超声波协同酶法提取菊苣根多糖工艺优化

许 芳,吴雨龙,王俏娜,付爱叶,汪振炯,王仁雷,华 春,*

(1.南京师范大学生命科学学院，江苏南京 210046; 2.南京晓庄学院食品科学学院，江苏南京 211171; 3.江苏第二师范学院生命科学与化学化工学院，江苏南京 210013)

超声波协同酶法提取菊苣根多糖工艺优化

许 芳1,2,吴雨龙2,王俏娜2,付爱叶1,2,汪振炯2,王仁雷3,华 春2,*

(1.南京师范大学生命科学学院，江苏南京 210046; 2.南京晓庄学院食品科学学院，江苏南京 211171; 3.江苏第二师范学院生命科学与化学化工学院，江苏南京 210013)

目的:优化超声波协同酶法提取菊苣根多糖的工艺条件。方法:采用中心组合设计方法(Box-Behnken Design),建立以超声温度、超声时间、加酶量、酶解时间和液料比对菊苣根多糖得率的影响的二次回归模型。结果:菊苣根多糖提取的最佳工艺条件为超声温度45 ℃、超声时间35 min、加酶量1.6%、酶解时间1.8 h、液料比44∶1 (mL/g),在此条件下,菊苣根多糖的得率为46.75%,与预测得率47.71%接近。结论:该回归模型有极显著性,可以作为菊苣根多糖提取工艺的回归分析和参数优化。

菊苣根,多糖,超声波,纤维素酶,中心组合设计方法

菊苣(CichoriumintybusL.)为菊科菊苣属多年生药食两用草本植物,根肉质、短粗。菊苣主要分布在欧洲、亚洲、北非,我国北京、辽宁、新疆、江西等省市也有分布[1],是维吾尔族和蒙古族常用药材。菊苣根富含多糖、生物碱、萜类等多种生物活性物质[2-5],而菊苣多糖在降血糖[6-7]、降血脂[8]、抗氧化[9]、保肝[10]、延缓衰老[11-12]、提高机体免疫力[14]等方面都表现出了较好的生物活性。陈立阁等[13]更是发现奇可力多糖(菊苣多糖)具有抗肿瘤作用,主要体现在菊苣多糖能明显抑制S180荷瘤小鼠肿瘤的生长,延长S180荷瘤小鼠的生存时间,另对肝癌、胃癌细胞生长亦具有一定抑制作用。菊苣多糖的开发与应用也已成为食品、医药、生物工程等领域的重要研究方向。

关于植物多糖的提取方法有很多种,如热水浸提法、酸提、碱提、超滤膜法提取、CO2超临界萃取法等,但传统的热水浸提法提取的效率较低且耗时;酸提法和碱提法的酸碱度和作用时间需严格控制,否则会引起多糖的糖苷键断裂,影响多糖的提取率;超滤膜法必须知道多糖的相对分子质量,对于未知的多糖则无法控制;CO2超临界萃取法成本相对较高。目前,菊苣多糖的提取通常采用热水浸提法[15],近年来还出现了超声波提取法、微波提取法以及膜分离集成技术等[16-17],但有关超声波协同酶法提取菊苣根多糖的研究尚未见报道。超声波法在植物活性成分提取中具有提高提取率,缩短提取时间,增强提取物活性,节约能源等优势,具有常规提取方法难以达到的提取效果[18]。植物细胞的细胞壁主要由纤维素组成,而植物细胞中的活性成分被包裹在细胞壁内,利用纤维素酶特异性水解纤维素,破坏细胞壁,有利于胞内活性成分溶出,从而提高了植物活性成分的提取率[19]。有研究表明,在植物多糖的提取中,超声波与纤维素酶同时使用,具有协同作用,能显著提高多糖的提取率[20]。本实验利用中心组合设计方法(Box-Behnken Design),采用五因素三水平的响应曲面分析法优化了超声波协同酶法提取菊苣根多糖的工艺条件,不仅大大的提高了菊苣根多糖的得率,降低了成本,而且不影响菊苣根多糖的结构与生物活性,为合理开发利用菊苣资源,提高其附加值以及综合应用提供可靠的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菊苣根 黄石市润生农业科技发展有限公司,烘干后粉碎备用；纤维素酶(酶比活力>400 U/mg) 南京奥多福尼生物科技有限公司;其它试剂均为分析纯。

超声波清洗仪KQ.250B 江苏省昆山市超声仪器有限公司;RE-3000旋转蒸发器、SHZ-Ⅲ型循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂;T6紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;IEC1010-1台式冷冻干燥机 美国Labconco公司;BR4I高速冷冻离心机 美国热电公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菊苣根多糖的提取工艺 菊苣根(切成片状)→烘干(60 ℃干燥至水分含量为5%)→粉碎→过60目筛→除脂→准确称取一定量菊苣根粉末→加蒸馏水→加纤维素酶→调节pH→酶解→灭酶→超声波处理→离心取上清液(4500 r/min,10 min)→加5倍体积95%乙醇沉淀→4 ℃冰箱静置过夜→离心取沉淀(4500 r/min,10 min)→收集沉淀冷冻干燥得菊苣根多糖→加水溶解→苯酚-硫酸法测吸光度[21]。

1.2.2 菊苣根多糖含量的测定

1.2.2.1 标准曲线的绘制 精确称取10.00 mg葡萄糖(105 ℃干燥至质量恒重),置于100 mL容量瓶中定容。精确量取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL,分别置于比色管中,按苯酚-硫酸法测定各管吸光度,另取蒸馏水2 mL(按苯酚-硫酸法进行显色反应),作为空白对照,于波长 490 nm 处测定吸光度,以葡萄糖浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,得标准曲线回归方程:y=7.56x+0.175,R2=0.9982。

1.2.2.2 菊苣根多糖得率的测定 取菊苣根多糖供试液1 mL于试管中,以去离子水补加到2 mL,按苯酚-硫酸法进行操作,于490 nm处测定吸光度,按标准曲线计算菊苣根多糖含量。菊苣根多糖得率按以下公式计算:

式中:C为菊苣根多糖浓度,mg/mL;V为菊苣根多糖溶液体积,mL;N为稀释倍数;M为菊苣根粉末质量,g。

1.2.3 单因素实验 以蒸馏水为提取溶剂,超声功率为250 W,依次固定超声温度40 ℃、超声时间40 min、加酶量2%、酶解时间1.5 h、液料比40∶1 (mL/g),分别考察不同超声温度、超声时间、加酶量、酶解时间和料液比对菊苣根多糖得率的影响,各实验重复3次。

1.2.4 中心组合设计方法优化提取工艺设计 在单因素实验结果的基础上,采用Box-Behnken Design设计方法[22],以超声温度、超声时间、加酶量、酶解时间和料液比为自变量,以菊苣根多糖得率为响应值设计实验,并采用响应面分析法来分析各因素之间的交互作用,以确定最佳的工艺条件。实验因素和水平见表1。

表1 中心组合设计的因素与水平设计

1.2.5 统计学分析 采用Graphpad prism 6对数据进行处理和分析,并采用Design-Expert 8.0软件对响应面实验结果进行分析,考察二次回归模型及因素的显著性(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

图1 超声温度、超声时间、加酶量、酶解时间和液料比对菊苣根多糖得率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic temperature,ultrasonic time,enzyme dosage,enzymolysis time and liquid-to-solid ratio on extraction yield of Chicory roots polysaccharides

由图1A可知,菊苣根多糖得率随着超声温度的增加而提高,当温度达到40 ℃时菊苣根多糖得率达到最高(37.44%),后随着超声温度的增加菊苣根多糖得率开始下降。原因可能是随着超声温度的升高,水中的小气泡(空化核)增多,对产生空化作用有利,菊苣根细胞破裂加速,菊苣根多糖溶出增加,但超声温度过高时,气泡中的蒸气压太高,将增强气泡闭合时的缓冲作用,导致空化作用减弱,导致菊苣根多糖的得率降低[23];另随着超声温度的升高,纤维素酶的活性增强,菊苣根多糖溶出增加,但当超声温度过高时会导致纤维素酶失活,从而影响菊苣根多糖的得率[24]。因此,选择40 ℃作为本实验超声温度。

由图1B可知,菊苣根多糖得率随着超声时间的增加而提高,当时间达到40 min时菊苣根多糖得率达到最高(38.29%),后随着超声时间的增加菊苣根多糖得率开始下降。原因可能是超声波具有的机械效应,空化效应和热效应使得菊苣根的细胞瞬间破碎,从而使菊苣根多糖快速溶出,而超声时间过长可能会导致多糖被破坏,影响菊苣根多糖的得率[25]。另外,因超声时间过长耗能增加,成本升高,考虑到生产成本,暂定超声时间为40 min。

由图1C可知,菊苣根多糖得率随着添加的纤维素酶量的增加而不断提高,当加酶量为1.5%时,菊苣根多糖含量为35.89%;当加酶量超过1.5%后,随着加酶量的增加,菊苣根多糖得率的增加趋于平缓。原因可能是由于菊苣根细胞的细胞壁含大量纤维素,经纤维素酶酶解后导致细胞壁被破坏,从而使得菊苣根多糖快速溶出,菊苣根多糖得率增加;当加酶过多时由于没有反应底物,从而使得菊苣根多糖得率维持在稳定的水平[26]。考虑到增加纤维素酶对菊苣根多糖提取率的提高没有明显作用,故选择纤维素酶的添加量为1.5%。

由图1D可知,菊苣根多糖得率随着酶解时间的增加而不断提高,当酶解时间为2.0 h时,菊苣根多糖含量达37.58%;当酶解时间超过2.0 h时,随着时间的延长,菊苣根多糖得率趋于平缓甚至略有下降。原因可能是刚开始酶的底物比较充足,随着时间的延长,底物不断减少直至酶解反应结束时,即使酶解时间继续延长，菊苣根多糖得率也不会继续增加,甚至可能由于酶解时间的延长,其它因素对多糖造成破坏,反而使多糖得率降低,这与玄光善等[26]提取桦褐孔菌多糖的结果类似,所以最适酶解时间为2.0 h。

由图1E可知,菊苣根多糖得率随着液料比的增加而不断提高,当液料比达40∶1 (mL/g)时,菊苣根多糖得率达最大值(35.25%),此后随着液料比的增加菊苣根多糖得率反而降低。原因可能是液料比越大,即水溶剂用量越大,越有利于水溶性菊苣根多糖的溶出,导致菊苣根多糖得率增加,但当液料比达一定值后,随着水溶剂用量的增加,会造成提取液中纤维素酶浓度的降低,也会造成单位提取液中菊苣根多糖浓度的降低,导致菊苣根多糖提取率的下降,同时还增加了后续浓缩工作中的能耗[26]。因此,综合提取效果和降低成本等方面考虑,选择液料比为40∶1 (mL/g)左右比较合适。

2.2 中心组合设计实验结果分析

2.2.1 菊苣根多糖得率回归模型的建立与分析 中心组合设计实验结果分析见表2,运用Design-Expert 8.0软件进行多元回归拟合,建立以菊苣根多糖得率与各提取条件之间的响应面回归模型,得二次多项式回归方程:

Y=43.12+2.22X1-2.80X2+4.21X3-1.66X4-1.06X5-3.60X1X2+0.68X1X3-1.68X1X4+8.95X1X5+1.10X2X3+4.45X2X4+0.65X2X5+1.53X3X4-0.15X3X5-4.50X4X5-7.24X12-4.21X22+1.62X32-4.09X42-6.26X52

表2 中心组合设计实验设计与结果

为验证回归方程的有效性,对菊苣根多糖得率的回归模型进行方差分析,结果见表3。由表3可知,菊苣根多糖得率的回归模型具有极显著性(p<0.0001),且失拟性具有不显著性(p>0.05),说明该回归模型比较好。Joglekar等[27]指出复相关系数(R2)大于0.80,且校正复相关系数(AdjR2)和预测复相关系数(PredR2)较为接近的情况下,表明方程的拟合度较好。回归方程中R2=0.9700,说明该模型能够解释97.00%响应值的变化;AdjR2=0.9460,PredR2=0.9263,二者较为接近,说明该模型具有较好的回归性。因此,该回归方程可以很好的对超声波法协同酶法提取菊苣根多糖的得率进行预测与分析。从5个因素对菊苣根多糖得率的影响来看,一次项中X2、X3、X5,二次项中X12、X22、X42、X52,交互项中X1X2、X1X5、X2X4、X4X5对菊苣根多糖得率影响极显著。由F值可知,各因素对菊苣根多糖得率的影响次序依次为X3>X2>X5>X4>X1。

表3 菊苣根多糖得率回归模型方差分析表

2.2.2 菊苣根多糖得率响应面两因素具明显交互作用分析 由图2A可知,当超声时间一定时,菊苣根多糖得率随超声温度的升高呈先上升后下降的趋势;当超声温度一定时,菊苣根多糖得率随超声时间的延长呈先上升后下降趋势。由图2B可知,当液料比一定时,菊苣根多糖得率随超声温度的升高呈先上升后下降的趋势;当超声温度一定时,菊苣根多糖得率随液料比的增加也呈先上升后下降的趋势。由图2C可知,当酶解时间一定时,菊苣根多糖得率随超声时间的增加呈先上升后下降的趋势;当超声时间一定时,菊苣根多糖得率随酶解时间的延长而上升。由图2D可知,当液料比一定时,菊苣根多糖得率随酶解时间的延长而上升;当酶解时间一定时,菊苣根多糖得率随液料比的增加呈先上升后下降的趋势。

2.2.3 菊苣根多糖最佳提取工艺条件的确定和验证 根据二项回归模型的预测,得出菊苣根多糖最佳提取工艺条件为超声温度44.24 ℃、超声时间35.51 min、加酶量1.58%、酶解时间1.73 h、液料比43.76∶1(mL/g)。考虑到实际操作的便利性,修正菊苣根多糖最佳提取工艺条件为超声温度45 ℃、超声时间35 min、加酶量1.6%、酶解时间1.8 h、液料比44∶1 (mL/g),在此条件下,菊苣根多糖的实际得率为46.75%(3次平行实验),与预测得率47.71%接近,表明该模型与实际情况拟合较好,可以用来预测实验结果,可以作为超声波协同酶法提取菊苣根多糖的工艺的回归分析和参数优化。

超声波协同酶法可以使植物组织的细胞结构被破坏,使得植物组织中的多糖成分快速溶解到提取溶剂中,使得多糖提取率明显高于传统提取法,而且对多糖的结构和活性无影响[28]。Ebringerova等[29]研究表明在一定的超声波条件下不仅不会造成水溶性活性分子结构的破坏和分子特性的改变,而且还通过免疫细胞实验证明超声波有利于增强提取物的生物活性。本实验采用超声波协同纤维素酶法提取菊苣根中的多糖,得率达46.75%,与庄红艳等[30]提出的关于菊苣中菊苣多糖的含量不低于43.056%相一致,且显著高于尔西丁·买买提等[15]以及周俊等[31]用传统方法提取菊苣多糖的得率(分别为3.80 mg/g和7.0745 mg/g),提示菊苣根多糖具有较好的开发潜力。

3 结论

采用超声波协同酶法提取菊苣根中多糖,根据单因素实验和中心组合设计实验研究获得菊苣根多糖提取的最佳工艺条件为超声温度45 ℃、超声时间35 min、加酶量1.6%、酶解时间1.8 h、液料比44∶1 (mL/g),且在此条件下菊苣根多糖的最终得率为46.75%,证明该回归模型可以优化菊苣根多糖提取工艺的参数,提高多糖得率,节约成本,具有一定实际参考价值。

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Optimization of extraction technology of polysaccharide from roots ofCichoriumintybusL. by ultrasound assisted with enzyme hydrolysis

XU Fang1,2,WU Yu-long2,WANG Qiao-na2,FU Ai-ye1,2,WANG Zhen-jiong2,WANG Ren-lei3,HUA Chun2,*

(1.College of Life Sciences,Nanjing Normal University,Nanjing 210046,China; 2.School of Food Science,Nanjing Xiaozhuang University,Nanjing 211171,China; 3.School of Life Science and Chemistry,Jiangsu Second Normal University,Nanjing 210013,China)

Objective:Optimization of extraction technology of polysaccharide from roots ofCichoriumintybusL. by ultrasound assisted with enzyme hydrolysis. Methods:To establish the effects of ultrasonic temperature,ultrasonic time,enzyme dosage,enzyme solution time and liquid to solid ratio onChicoryroots polysaccharide yield of quadratic regression model by using Box-Behnken design. Results:The optimum extraction conditions of polysaccharide from roots ofCichoriumintybusL. were ultrasonic temperature 45 ℃,ultrasonic time 35 min,enzyme dosage 1.6%,enzymolysis time 1.8 h,liquid-to-solid ratio of 44∶1 (mL/g). Under these conditions,the extraction ofChicoryroots polysaccharide was 46.75%,closed to the predicted yield of 47.71%. Conclusion:The regression model was significant,could be used as thechicoryroots polysaccharide extraction process of regression analysis and parameter optimization.

Chicoryroots;polysaccharide;ultrasound;cellulose;Box-Behnken Design

2016-11-14

许芳(1990-),女,硕士研究生,研究方向：植物生理生化,E-mail:wyl_8080@sina.com。

*通讯作者:华春(1963-),女,本科,教授,研究方向：植物生理生化,E-mail:hc3501988@163.com。

国家高技术研究发展计划(2012AA021701);国家自然科学基金(21376112);江苏省自然科学基金(BK20141081);南京市环境科学与工程重点学科建设项目(20141123);江苏省高等学校大学生创新创业训练计划项目(201611460001Z)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)09-0168-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.024