蒌叶挥发油的提取及抗氧化和抑菌活性研究

吕纪行,纪明慧,郭飞燕,陈光英,翟富荣

(1.南京大学化学化工学院,江苏南京 210023; 2.海南师范大学化学与化工学院,海南海口 571158)

蒌叶挥发油的提取及抗氧化和抑菌活性研究

吕纪行1,纪明慧2,*,郭飞燕2,*,陈光英2,翟富荣2

(1.南京大学化学化工学院,江苏南京 210023; 2.海南师范大学化学与化工学院,海南海口 571158)

采用水蒸气提取法对蒌叶挥发油进行提取,在单因素实验的基础上,以正交实验筛选最佳的提取工艺条件;同时考察蒌叶挥发油抗氧化和抑菌活性。结果表明,蒌叶挥发油提取的最佳工艺条件为:料液比m干蒌叶粉∶V水=50∶1000(g/mL),超声时间为30 min,超声温度70 ℃,超声功率192 W,加热回流提取4 h,蒌叶挥发油的得率为2.96%。蒌叶挥发油清除DPPH·和·OH的IC50分别为33.19、71.11 μg/mL;挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、四联球菌、藤黄八叠球菌、白色葡萄球菌、黑曲霉、毛霉、青霉均有明显的抗菌活性,其MIC分别为0.625、1.25、0.625、0.625、0.625、2.50、1.25、0.313、0.625、0.313 mg/mL,故蒌叶挥发油具有较强的抗氧化和抑菌活性。

蒌叶,挥发油,抗氧化,抑菌

蒌叶(PiperbetleL.),别名青蒟、芦子、大芦子、槟榔蒟、槟榔蒌,是我国南方大量生长和民间广泛使用的一种具有特殊芳香气味的胡椒科胡椒属药用植物,其根、籽、叶皆可入药,具有祛风散寒、行气化痰、消肿止痒之功效,外用可治皮肤湿疹、脚癣等疾病[1-2]。现代研究表明,蒌叶富含有挥发油、生物碱、木脂素和一些酚类化合物[3-6],具有复杂的化学成分和广泛的药理活性[7-8]。但是,目前,蒌叶更多的是被用与槟榔一起嚼食,没有其它的研究和开发利用,为了充分利用这一资源,本文试图通过提取蒌叶挥发油、抑菌性实验和抗氧化性实验来探明其医药和保健作用的内在本质,从而为蒌叶的进一步开发和利用提供科学依据,为综合开发利用海南蒌叶提供方向和新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蒌叶 采集于海南省万宁市,经海南师范大学生命科学学院钟琼芯老师鉴定为胡椒科植物,将蒌叶烘干粉碎成粉末备用;枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌、四联球菌、藤黄八叠球菌、黑曲霉、毛霉、青霉 由海南师范大学生命科学学院微生物教研室提供;二甲基亚砜、氯化钠、无水硫酸钠、邻二氮菲 分析纯,天津市化学试剂一厂;石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇 分析纯,西陇化工股份有限公司;30% H2O2溶液 分析纯,广州化学试剂厂;Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷(pH6.0);维生素C,七水合硫酸亚铁 分析纯,天津市同鑫化工有限公司;胰蛋白胨、酵母浸膏、琼脂粉、改良马丁、营养肉汤。

表1 L25(56)正交实验因素水平表

KDM型调温电热套 山东省堙城永兴仪器厂;TU-1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;DZF-6050真空干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;pHS-3C精密pH计 上海康仪仪器有限公司;Sartorius BT-124S精密天平 赛多利斯科学仪器有限公司;HP6890/5973MSD毛细管气相色谱-质谱联用仪 美国Hewlett-Packark公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件的选择 气相色谱条件:石英毛细管柱HP-FFAP(30 m×0.25 mm,0.25 μm),程序升温:从60 ℃开始,以4 ℃/min升到150 ℃,再以8 ℃/min升温到250 ℃,保留3 min,载气为He(99.99%),柱流量1.0 mL/min,进样口温度250 ℃,分流比80∶1。

质谱条件:EI源;电离电压70 eV,离子源温度230 ℃,扫描范围40～500 aum,进样量0.5 μL。

1.2.2 蒌叶挥发油提取的工艺研究

1.2.2.1 料液比对蒌叶挥发油提取的影响 把蒌叶晾干粉碎,各取6份50.0 g蒌叶干粉置于2000 mL圆底烧瓶中,分别加入:300、400、700、1000、1300、1600 mL水在超声时间30 min、超声温度60 ℃、超声功率192 W的条件下进行超声处理,以加快提取速度,然后再进行水蒸气蒸馏提取蒌叶挥发油2 h,提取完毕,用少量乙醚洗涤和萃取,挥干乙醚后用减量法计算挥发油质量,通过公式:蒌叶挥发油的得率(%)=挥发油质量(g)/蒌叶质量(g),计算蒌叶挥发油的得率。用GC-MS测定其挥发油的化学成分。

1.2.2.2 超声时间对蒌叶挥发油提取的影响 在料液比50∶1000 g/mL、超声温度60 ℃、超声功率192 W、水蒸气蒸馏提取蒌叶挥发油2 h不变的条件下,改变超声时间10、20、30、40、50、60 min对蒌叶挥发油进行提取,提取完毕按1.2.2.1节对挥发油进行处理,计算挥发油得率。

1.2.2.3 超声温度对蒌叶挥发油提取的影响 在料液比50∶1000 g/mL、超声时间30 min、超声功率192 W、水蒸气蒸馏提取蒌叶挥发油2 h不变的条件下,改变超声温度40、50、60、70、80 ℃对蒌叶挥发油进行提取,提取完毕按1.2.2.1节对挥发油进行处理,计算挥发油得率。

1.2.2.4 超声功率对蒌叶挥发油提取的影响 在料液比50∶1000 g/mL、超声时间30 min、超声温度70 ℃、水蒸气蒸馏提取蒌叶挥发油2 h不变的条件下,改变超声功率48、96、144、192、240 W对蒌叶挥发油进行提取,提取完毕按1.2.2.1节对挥发油进行处理,计算挥发油得率。

1.2.2.5 水蒸气蒸馏提取时间对蒌叶挥发油提取的影响 在料液比50∶1000 g/mL、超声时间30 min、超声温度70 ℃、超声功率192 W不变的条件下,改变水蒸气蒸馏提取时间1、2、3、4、5、6、7 h,对蒌叶挥发油进行提取,提取完毕按1.2.2.1节对挥发油进行处理,计算挥发油得率。

1.2.2.6 蒌叶挥发油提取的正交实验 通过单因素实验得知,料液比(A)、超声时间(B)、超声温度(C)、超声功率(D)、水蒸气蒸馏提取时间(E)对蒌叶挥发油的提取有一定的影响。故设计五因素五水平的正交实验。取50.0 g蒌叶干粉置于2000 mL圆底烧瓶中,按比例加入一定量的水进行超声处理,以加快提取速度,然后再进行水蒸气蒸馏提取蒌叶挥发油,提取完毕按1.2.2.1节对挥发油进行处理,计算挥发油得率。用表L25(56)安排实验,因素水平表见表1,用GC-MS测定其挥发油的化学成分。

1.2.3 蒌叶挥发油的抗氧化活性测定

1.2.3.1 挥发油对·OH 的清除作用 精确称取100.0 mg的蒌叶挥发油,加无水乙醇溶解,定容至10 mL容量瓶中,配制成10.0 mg/mL蒌叶挥发油乙醇溶液,然后不断稀释配制浓度分别为50.0、60.0、70.0、80.0、100.0、120.0 μg/mL的蒌叶挥发油乙醇溶液。同时配制相同浓度的VC水溶液,考察挥发油和VC对·OH清除作用。参照文献[9-10]的方法进行测定。

1.2.3.2 挥发油对 DPPH·的清除作用 精确称取100.0 mg的蒌叶挥发油于10 mL的容量瓶中,加入无水乙醇溶解并定容,得10.0 mg/mL蒌叶挥发油乙醇溶液,然后不断稀释配制浓度分别为10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL蒌叶挥发油乙醇溶液,同时配制相同浓度的VC水溶液,考察挥发油和VC对DPPH·的清除作用。参照文献[9-10]的方法进行测定。

1.2.4 抑菌活性的测定

1.2.4.1 抑制细菌活性测定 分别称取胰蛋白胨(25 g)、酵母提取物(12.5 g)、NaCl(25 g)和蒸馏水(2500 mL)配制约2500 mL的液体培养基。然后进行液体培养基接种各种菌种,将液体培养的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌、四联球菌、藤黄八叠球菌用培养液按1∶1000比例进行稀释。

配制50.0 mg/mL的蒌叶挥发油DMSO溶液,采用二倍稀释法用上述含菌的稀释培养液进行稀释,配制成浓度为10.00、5.00、2.50、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078 mg/mL的蒌叶挥发油DMSO 溶液,以不加样品的DMSO为空白,参照文献[11-12]的方法,采用96孔板法测定其对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌、四联球菌、藤黄八叠球菌的抑制活性,实验平行3次,观察记录MIC值。

1.2.4.2 抑制真菌活性测定 参照文献[11-12]的方法,用倾注平板法测定挥发油对黑曲霉、毛霉和青霉的抑制活性。

分别称取改良马丁(16.8 g)、琼脂粉(9.0 g)于烧杯中,加入600 mL蒸馏水加热溶解制备约600 mL培养基,灭菌备用。用已灭菌的移液管(5 mL)取不同浓度(100.0、50.00、25.00、12.50、6.250、3.125、1.563、0.781 mg/mL)的蒌叶挥发油乙醇溶液各5 mL,以不加样品的无水乙醇为空白对照进行实验,分别置于无菌的空培养皿(直径9 cm)内,再加入经过高压灭菌后温度冷却至50 ℃左右的培养基20 mL,总体积为25 mL,充分拌匀,使受试溶液在培养基中的浓度依次为20.0、10.0、5.00、2.50、1.25、0.625、0.313、0.156 mg/mL。待培养基凝固后,用接种环分别挑取已活化的黑曲霉、毛霉和青霉,划S线接种于含样品溶液平板的表面,划好后放在28 ℃恒温培养箱培养48 h,观察记录MIC值,实验平行3次。

2 结果与分析

2.1 蒌叶挥发油提取工艺研究

2.1.1 料液比对蒌叶挥发油提取的影响 料液比对蒌叶挥发油提取质量的影响结果如图1所示。

图1 料液比对蒌叶挥发油提取的影响Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction of the essential oil from Piper betle L.

由图1可知,当料液比50∶300～50∶1000 (g/mL)时,蒌叶挥发油提取质量随着加水量的增大而增加;但当料液比大于50∶1000 (g/mL)时,挥发油提取质量随着水量的增加而缓慢下降。加水量过小时,由于蒌叶样品量大,蒌叶没有得到充分浸提,挥发油提取量也相应较小;加水量过大时,提高了挥发油溶于热水中的速度和质量,从而造成了一定的损失,且水量的增加同时也增加了加热时间,增加了能耗。因此,最佳料液比为50∶1000 (g/mL)。

2.1.2 超声时间对蒌叶挥发油提取的影响 超声时间对蒌叶挥发油提取质量的影响结果如图2所示。

图2 超声时间对蒌叶挥发油提取的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on extraction of the essential oil from Piper betle L.

由图2可知,当超声时间在10～30 min时,蒌叶挥发油提取量随着超声时间的增加而增加;当超声时间大于30 min时,挥发油的提取量随着超声时间的增加趋于稳定。这是因为超声波强化蒌叶挥发油提取在30 min即可获得最佳提取质量,增加超声时间对挥发油质量的提高并不明显,故超声时间为30 min。

2.1.3 超声温度对蒌叶挥发油提取的影响 超声温度对蒌叶挥发油提取质量的影响结果如图3所示。

图3 超声温度对蒌叶挥发油提取的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on extraction of the essential oil from Piper betle L.

由图3可知,当超声温度在40～70 ℃时,蒌叶挥发油提取质量随着超声温度的升高而增加;当超声温度大于70 ℃时,挥发油提取质量随着超声温度的增加而呈下降的趋势。超声温度的增加加大了挥发油的释放速度,有利于提取,但温度过高会导致挥发油分子的快速挥发和氧化而造成一定的损失。同时能耗也随之增大,因此,超声温度为70 ℃时是最佳选择。

2.1.4 超声功率对蒌叶挥发油提取的影响 超声功率对蒌叶挥发油提取质量的影响结果如图4所示。

图4 超声功率对蒌叶挥发油提取的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction of the essential oil from Piper betle L.

由图4可知,当超声功率为48～192 W时,蒌叶挥发油提取质量随着超声功率增大而增加;当超声功率大于192 W时,挥发油提取质量随着超声功率的增大而降低。功率过低,提取效率慢,随着超声功率的增大,加大挥发油分子的运动速度,使挥发油提取更充分,因此选择192 W为最佳超声功率。

2.1.5 水蒸气蒸馏提取时间对蒌叶挥发油提取的影响 水蒸气蒸馏提取时间对蒌叶挥发油提取质量的影响结果如图5所示。

图5 水蒸气提取时间对蒌叶挥发油提取的影响Fig.5 Effect of hydrodistillation time on extraction of the essential oil from Piper betle L.

由图5可知,以水蒸气提取法对蒌叶挥发油进行提取,当提取时间为1～4 h时,挥发油提取质量随着提取时间的延长而增加;而后再增加提取时间对挥发油的提取量影响不大。提取时间过短,挥发油成分不能被充分提取;提取时间太长会造成挥发油的氧化或分解,从而降低提取量,因此,提取时间为4 h是最佳选择。

2.1.6 蒌叶挥发油提取工艺研究的正交实验 在单因素的基础之上,通过正交实验对料液比、超声时间、超声温度、超声功率、水蒸气蒸馏提取时间条件进行优化。正交实验结果见表2,方差分析见表3。

表2 L 25(56)正交实验设计和结果极差分析

表3 正交实验结果方差分析

表4 水蒸气蒸馏提取蒌叶挥发油的化学成分GC-MS分析结果

超声波辅助提取蒌叶挥发油的正交实验结果与分析见表2和表3。从表2直观分析结果可知,极差RA>RB>RD>RE>RC,因素影响次序为A>B>D>E>C,即蒌叶与水的比例为主要影响因素,对蒌叶挥发油提取结果影响最大,超声波温度影响最小。表3的方差分析结果表明,料液比、超声时间、超声温度、超声功率和水蒸气蒸馏提取时间对实验结果没有显著性影响(p>0.05)。虽然所选择的五个因素对实验结果没有显著性差异,但根据单因素实验和正交实验结果可知,不同的水平因素对实验结果有一定的影响,因此,最佳工艺条件为A3B3C4D4E4,即m干蒌叶粉∶V水=50∶1000(g/mL),超声时间为30 min,超声温度70 ℃,超声功率192 W,水蒸气蒸馏提取4 h,挥发油提取效果较好。以此工艺条件验证 3次,蒌叶挥发油的平均提取质量为1.48 g,蒌叶挥发油的得率为2.96%。

2.2 蒌叶挥发油的GC-MS分析

上述方法提取所得的挥发油化学成分用毛细管气相色谱法进行分析,分离出23个组分(图6)。用Hewlett-packard软件按峰面积归一化法计算各峰峰面积的相对强度,并对化合物进行定量分析。根据GC/MS联用所得的质谱信息,用NBS数据库检索与标准谱图对照、分析,鉴定了蒌叶挥发油中的化学成分。结果列于表4。

表5 蒌叶挥发油对细菌抑菌作用的最小抑菌浓度

图6 水蒸气蒸馏提取蒌叶挥发油的GC-MS离子总图Fig.6 GC-MS total ion current chromatogram of the essential oil from Piper betle L.

注：“+”表示有菌生长,“-”表示无菌生长,表6同。 从表4中可知,水蒸气蒸馏法提取的蒌叶挥发油中共检测出23种组分,鉴定出化合物22种,占总峰面积的99.74%;蒌叶挥发油中有酚类、醇类、烯烃类等有机物,含量较高的组分为:2-甲氧基-4-(1-丙烯基)-苯酚(含量67.141%);4-烯丙基苯酚(胡椒酚)(含量13.453%);2-甲氧基-4-丙烯基乙酸酚酯(含量9.617%)。其中2-甲氧基-4-(1-丙烯基)-苯酚可用于配制香精和制备香兰素,在化妆品、食品行业有广泛的用途[13];4-烯丙基苯酚(胡椒酚)具有抗菌、解痉、镇静及升高白细胞的作用[14]。

2.3 蒌叶挥发油抗氧化活性研究

2.3.1 蒌叶挥发油对·OH的清除作用 由图7可知,蒌叶挥发油对·OH有一定的清除能力,随着浓度的增加,清除率也增加,浓度与清除率有一定正量效关系,蒌叶挥发油清除·OH的IC50=71.11 μg/mL,同时测定了VC对·OH 的清除能力,其IC50=97.76 μg/mL,蒌叶挥发油对·OH 的清除能力大于 VC对·OH 的清除能力。

图7 蒌叶挥发油对·OH的清除作用Fig.7 Scavenging capacity against ·OH of the essential oil from Piper betle L.

2.3.2 蒌叶挥发油对DPPH·的清除作用 由图8可知,蒌叶挥发油对DPPH·有一定的清除能力,随着浓度的增加,清除率也增加,浓度与清除率有一定正量效关系,蒌叶挥发油清除DPPH·的IC50=33.19 μg/mL,同时测定了VC对DPPH· 的清除能力,其 IC50=73.74 μg/mL,蒌叶挥发油对DPPH·清除能力好于VC。

图8 蒌叶挥发油对DPPH·的清除作用Fig.8 Scavenging capacity against DPPH· of the essential oil from Piper betle L.

实验结果表明,蒌叶挥发油具有较强的抗氧化活性,其抗氧化活性高于VC,这可能与蒌叶挥发油中含有大量的酚类化合物有关,据文献报导,酚类化合物具有很强的抗氧化活性,而酚类抗氧化剂的作用机制主要是通过酚羟基的抽氢反应直接清除自由 基[15],这些化合物与自由基之间进行一系列反应,可阻断自由基对人体生物大分子的损伤和氧化,减少人体心血管等一些疾病的发病[16]。

2.4 蒌叶挥发油抑菌活性研究

2.4.1 蒌叶挥发油对细菌抑菌作用的最小抑菌浓度 从表5中可知,蒌叶挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、四联球菌、藤黄八叠球菌、白色葡萄球菌均有一定的抑制作用,其中最小抑菌浓度分别为0.625、1.25、0.625、0.625、0.625、2.50、1.25 mg/mL。因此,蒌叶挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡状芽孢杆、四联球菌的抑制效果较佳。

2.4.2 蒌叶挥发油对真菌抑菌作用的最小抑菌浓度 从表6可知,蒌叶挥发油对黑曲霉、毛霉、青霉均有明显的抗菌活性,其最小抑菌浓度分别为0.313、0.625、0.313 mg/mL,因此,蒌叶挥发油对黑曲霉、青霉抑制效果较佳。

实验结果表明,蒌叶挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、藤黄八叠球菌、四联球菌、白色葡萄球菌、黑曲霉、毛霉、青霉均有明显的抑菌活性,蒌叶挥发油中含有大量的活性物质,如4-烯丙基苯酚(胡椒酚)、丁子香酚这些天然的有机分子可阻碍细菌等微生物代谢作用和生理活动,破坏菌体的结构,最终导致菌体的生长繁殖被抑制[17-18]。这就是为什么蒌叶在民间作为对防寄生虫、细菌性传染病有作用[1-2]而被广泛运用的科学原因。

表6 蒌叶挥发油对真菌抑菌作用的最小抑菌浓度

3 结论

通过用水蒸气提取法对蒌叶进行提取,并用GC-MS分析其成分,寻找出最合适的提取工艺。水蒸气蒸馏法提取的蒌叶挥发油中共检测出23种组分,鉴定出化合物22种,占总峰面积的99.74%;蒌叶挥发油中有酚类、醇类、烯烃类等有机物,含量较高的组分为:2-甲氧基-4-(1-丙烯基)-苯酚(含量为67.141%);4-烯丙基苯酚(胡椒酚)(含量为13.453%);2-甲氧基-4-丙烯基乙酸酚酯(含量为9.617%)。当料液比为m干蒌叶粉∶V水=50∶1000 g/mL,超声时间为30 min,超声温度70 ℃,超声功率192 W,水蒸气蒸馏提取4 h,挥发油提取效果较佳,蒌叶挥发油的得率为2.96%。

蒌叶挥发油清除DPPH·自由基和·OH自由基的IC50分别为33.19、71.11 μg/mL;挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、四联球菌、藤黄八叠球菌、白色葡萄球菌、黑曲霉、毛霉、青霉均有明显的抗菌活性,其最小抑菌浓度分别为0.625、1.25、0.625、0.625、0.625、2.50、1.25、0.313、0.625、0.313 mg/mL,故蒌叶挥发油是很好的抗氧化剂和抑菌物质。

蒌叶富含挥发油,其挥发油具有特殊芳香气味,可用于制做香精香料,结合其优良抗氧化和抑菌活性,可广泛应用于化妆品、食品、日用品和药品行业中。

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Extraction,antioxidant capacity and antibacterial activities of essential oil fromPiperbetleL.

LV Ji-xing1,JI Ming-hui2,*,GUO Fei-yan2,*,CHEN Guang-ying2,ZHAI Fu-rong2

(1. School of Chemistry and Chemical Engineering,Nanjing University,Nanjing 210023,China; 2. School of Chemistry and Chemical Engineering,Hainan Normal University,Haikou 571158,China)

The essential oil was extracted by hydrodistillation,and the best extraction technology were studied through single factor experiment and orthogonal experiment.The antioxidant and antimicrobial activities of the essential oil fromPiperbetleL. were investigated. The results indicated that the optimal conditions were solid-to-liquid ratio 50∶1000 g/mL,ultrasonic time of 30 min,extraction temperature of 70 ℃,ultrasonic power of 192 W,heated refluxed of 4 h,the extraction rate ofPiperbetleL. essential oil was 2.96%. The IC50of the oil for scavenging activities against DPPH free radical and hydroxyl free radical were 33.19 μg/mL and 71.11 μg/mL. The oil had certain antibacterial activity on the microorganisms,the minimal inhibitory concentration ofStaphyloccocusaureus,Bacillussubtilis,Escherichiacoli,Bacilluscereus,Micrococcustetragenus,Sarcinalutea,Staphylococcusalbus,Aspergillusniger,Mucor,Penicilliumwere 0.625,1.25,0.625,0.625,0.625,2.50,1.25,0.313,0.625,0.313 mg/mL,respectively. In conclusion,the essential oil fromPiperbetleL. had strong antioxidative and antibacterial activities.

PiperbetleL.;essential oil;antioxidant activity;antimicrobial activity

2016-10-21

吕纪行(1995-)，男，在读本科生，研究方向：化学，E-mail:lvjixing2008@vip.qq.com。

*通讯作者:纪明慧(1968-),女，硕士，副研究员，研究方向：天然产物研究与应用，E-mail:jimh66@163.com。 郭飞燕(1963-),女，本科，副教授，研究方向：天然产物研究与应用，E-mail:56801582@qq.com。

海南省社会发展科技专项(2015SF48)。

TS254.1

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1002-0306(2017)09-0075-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.006