不同滴度噬菌体D29对气道上皮细胞9HTE的生长及功能影响研究*

梁 梅,郭述良,张红梅

(1.重庆市渝北区人民医院呼吸内科 401120；2.重庆医科大学附属第一医院呼吸内科，重庆 400016；3.重庆市第五人民医院呼吸内科 400062)

不同滴度噬菌体D29对气道上皮细胞9HTE的生长及功能影响研究*

梁 梅,郭述良2△,张红梅3

(1.重庆市渝北区人民医院呼吸内科 401120；2.重庆医科大学附属第一医院呼吸内科，重庆 400016；3.重庆市第五人民医院呼吸内科 400062)

目的 研究噬菌体D29不同滴度对气道上皮细胞株9HTE的生长及功能影响。方法 分别用高滴度(109PFU/mL)和低滴度(107PFU/mL)噬菌体D29及噬菌体缓冲液组作用于9HTE细胞株后，用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测细胞生长情况；用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测量细胞上清液白细胞介素(IL)-6、IL-8水平；用逆转录PCR(RT-PCR)检测细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA的表达，用流式细胞技术检测细胞凋亡率。结果 高、低滴度噬菌体D29作用气道上皮细胞一段时间后，对细胞生长活性、细胞因子IL-6、IL-8和ICAM-1 mRNA的表达,以及细胞凋亡率的影响与噬菌体缓冲液组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 高、低滴度噬菌体D29对体外培养的气道上皮细胞生长及功能无明显影响。

细菌噬菌体；气管；白细胞介素类；血管细胞黏附分子1；气道上皮细胞；安全性

当前，结核病仍是全球最严重的公共卫生问题之一，2014年全球960万人患有结核病，其中150万人因感染结核而死亡，48万人为耐多药结核病。结核病耐药形势严峻，而现有的治疗方案无法达到令人满意的效果，因此急需研发新的治疗结核病的方法和制剂。噬菌体作为细菌病毒中的一种，能在感染细菌周期末期特异性裂解宿主菌,故可作为抗菌制剂而被用于研究[1]，特别是用于耐药菌的治疗[2]。噬菌体D29能裂解结核分枝杆菌，有望用于结核病的诊断和治疗。本课题组前期研究发现，噬菌体D29能裂解巨噬细胞内的结核分枝杆菌，使结核病模型豚鼠肝、脾脏器荷菌量减少，这为研制耐药结核病治疗用噬菌体制剂奠定了基础[3]。且前期研究还发现噬菌体D29通过呼吸道给入后到达肺部的滴度比皮下、肌内注射高，且维持时间长，表明气道给药可能有利于治疗肺结核[4]。但通过呼吸道给入噬菌体安全性如何还不得而知，本文通过对噬菌体D29对体外培养的气道上皮的生长和功能研究，以期了解噬菌体通过气道给药的安全性。

1 材料与方法

1.1 材料 试验材料：气道上皮细胞株9HTE，由重庆市儿童医院呼吸科实验室惠赠；噬菌体D29由中国药品生物制品检定所王国治教授惠赠。试剂：DMEM培养基(美国Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)，胰蛋白酶(美国Gibco公司)，四甲基偶氮唑蓝比色(MTT，超纯级，美国Amersco公司)，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国R&D公司分装)，Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒(凯基公司)。逆转录试剂盒、RNAiso、Plus、Tag酶、DNA Marker (上海宝生物公司)，引物序列由上海宝生物合成。

1.2 方法

1.2.1 9HTE细胞的培养 气道上皮细胞9HTE用含10%的FBS DMEM培养基(内含有4.0 mmol/L谷氨酰胺，4 500 mg/L葡萄糖)培养于50 mL培养瓶中，置于37 ℃，5%CO2细胞培养箱中培养，每隔1 d换液，待细胞于对数生长期时用于试验。

1.2.2 MTT比色法检测细胞增殖活性 取对数生长的9HTE细胞制成1×105/mL接种到96孔细胞培养板内，每孔150 μL，待过夜贴壁后换无血清培养液培养24 h，使细胞同步化于G0期。取出培养板后弃去无血清培养基，给药组加入噬菌体D29使得每孔终浓度分别为109、107PFU/mL(高滴度组、低滴度组)，每孔终体积均为200 μL，以噬菌体缓冲液(phage buffer)为阴性对照孔，均设置4个复孔，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱培养，24 h后，加入MTT(5 g/L)每孔20 μL后放入37 ℃、5%CO2细胞培养箱孵育4 h，以800 r/min，离心5 min，弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，轻轻振荡10 min，使紫色结晶完全溶解后，用全波长酶标仪于570 nm检测吸光度(A)值，该试验重复3次。细胞存活率=(A给药组-A空白组)/(A正常组-A空白组)×100%。其中给药组为试验干预组，正常组为未做任何处理组，空白组为单纯加入MTT细胞培养基组。

1.2.3 ELISA法检测细胞上清液白细胞介素(IL)-6、IL-8分泌水平 接种处于对数生长期的9HTE气道上皮细胞悬液以1×105/孔接种于24孔细胞培养板内，每孔500 μL待过夜贴壁后试验组加入噬菌体D29使每孔的最终浓度分别为109、107PFU/mL(高滴度组、低滴度组)，终体积为1 mL，均设置4个复孔；以phage buffer为阴性对照组，脂多糖(LPS，终浓度为10 mg/L)设置为阳性对照组，置入37 ℃、5%CO2细胞培养箱培养，2 d后，收集细胞上清液，3 000 r/min，离心20 min，取上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作，测上清液细胞因子IL-6、IL-8水平，该试验重复3次。

1.2.4 RT-PCR半定量检测气道上皮细胞细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA的表达 将对数生长的气道上皮细胞悬液以1×106/瓶接种到细胞培养瓶中，细胞过夜贴壁后加入噬菌体D29使每孔的终浓度分别为109、107PFU/mL(高滴度组、低滴度组)，终体积为3 mL；以phage buffer为阴性对照组，置入37 ℃、5%CO2细胞培养箱培养，2 d后按照说明书提取细胞总RNA,反转录合成cDNA链，加入Tag酶及上、下游引物，在PCR仪上进行PCR扩增。ICAM-1引物核苷酸序列：上游5′-GAG TCT GCT GGG AAT TTT CTG G-3′，下游5′-GAG GTG ACA GTG AAG TGT GAG G-3′，PCR循环参数为：94 ℃ 30 s变性，56 ℃ 30 s退火，共反应30循环；β-actin上游5′-TCC TGT GGC ATC CAC GAA ACT-3′,下游5′-GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT-3′。PCR循环参数为：94 ℃ 30 s变性，58 ℃ 30 s退火，共反应35循环，扩增产物琼脂糖电泳并扫描成像，计算机软件分析电泳条带灰度。

1.2.5 流式细胞仪对气道上皮细胞凋亡的检测 台盼蓝记数细胞活力大于95%的气道上皮细胞105/孔接种于24孔细胞培养板，细胞贴壁后换无血清DMEM培养基24 h，使细胞同步于G0期。试验组加入噬菌体D29使每孔终浓度分别为109、107PFU/mL(高滴度组、低滴度组)，终体积为1 mL；阴性对照组加入phage buffer，均设3个复孔，刺激48 h后，以无二乙胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰蛋白酶收集上清液和底壁细胞，以1 000 r/min离心5 min。用无菌PBS洗涤2次，沉淀以500 μL binding缓冲液悬浮细胞，加入5 μL AnnexinV-FITC混匀后再加入5 μL碘化丙啶(PI)，室温避光孵育10 min后立即用流式细胞仪检测。

2 结 果

2.1 高、低滴度噬菌体D29对9HTE细胞生长活性 高滴度和低滴度分别作用于气道上皮细胞9HTE不同时间12、24、48 h后，各组存活率见表1。采用重复测量方差分析，作用时间对9HTE细胞无明显影响(F=0.892,P=0.427)；高、低滴度对细胞生长活性比较差异无统计学意义(F=0.506,P=0.619)；作用时间及浓度之间不存在交互作用(F=1.053,P=0.408)。

表1 MTT法检测9HTE细胞增殖存活率结果

2.2 高、低滴度噬菌体D29对9HTE分泌细胞因子的影响

2.2.1 高、低滴度噬菌体D29对9HTE分泌IL-6的影响 用高、低滴度噬菌体D29作用于气道上皮细胞9HTE 48 h后，各组细胞上清液IL-6水平较少，高滴度组[(1.185±0.114)ng/L]、低滴度组[(1.193±0.932)ng/L]与阴性对照组[(1.238±0.443)ng/L]及正常组[(1.210±0.101)ng/L]两两比较差异无统计学意义(F=0.257，P=0.855)；阳性对照组[(3.788±0.048)ng/L]与正常组比较细胞因子水平明显升高，比较差异有统计学意义(t=46.123，P=0.000)。

2.2.2 高、低滴度分别对9HTE分泌IL-8的影响 高滴度组[(0.632±0.042)ng/L]、低滴度组[(0.596±0.163)ng/L]细胞上清液细胞因子IL-8水平与阴性对照组[(0.625±0.003)ng/L]及正常组[(0.609±0.025)ng/L]比较差异无统计学意义(F=1.568，P=0.248)；阳性对照组[(0.817±0.016)ng/L]与正常组比较细胞因子水平升高明显，比较差异有统计学意义(t=14.064，P=0.000)。

2.2.3 高、低滴度噬菌体D29对9HTE细胞表达ICAM-1的mRNA影响 高滴度组(2.76±0.27)和低滴度组(2.75±0.30)各组间ICAM-1 mRNA表达量与阴性对照组(2.84±0.15)和正常组(2.49±0.35)均比较差异无统计学意义(F=0.695，P=0.581)，见图1。

1:高滴度组；2:低滴度组；3:阴性对照组；4:正常组。

图1 各组9HTE细胞ICAM-1 mRNA的表达

2.2.4 流式细胞仪检测 高滴度组[(9.82±0.59)%]、低滴度组[(9.98±0.34)%]与阴性对照组[(10.09±0.32)%]、正常对照组[(10.56±0.18)%]凋亡率两两比较差异无统计学意义(F=1.992，P=0.194)。

3 讨 论

结核病耐药问题逐渐严重，故急需要开发新的抗菌药物，噬菌体D29裂解谱广，抗原性较高，能裂解耐药结核分枝杆菌，故有望用于肺结核病特别是耐药结核病的治疗[5]。结核病以肺部感染最多，通过课题组前期研究表明通过呼吸道给药噬菌体到达肺部量最多，药物量维持时间长[4,6]，保证其有效性，但目前国内外对噬菌体对气道上皮的功能及安全性研究甚少。

气道上皮细胞具有机械屏障作用，同时还有更重要的免疫炎症防御作用[7]，气道上皮细胞受刺激后可产生多种炎症介质，募集炎性细胞，诱发异常炎症反应，造成病理损伤[8]。IL-6在正常气道上皮细胞极少分泌，但在受刺激后分泌量增加，其主要功能是促进T、B细胞增殖活化，参与炎症反应，导致机体发热等，IL-8是一种化学趋化因子，可趋化并激活中性粒细胞到达炎症部位，发挥作用[9]。而ICAM-1属于免疫球蛋白超家族成员之一，参与调解炎症反应，细胞和组织之间分化和发育、免疫反应应答及淋巴细胞归巢和再循环等一些重要的生理功能[10]，也是大部分血清型鼻病毒、呼吸道合胞病毒等多种病毒的受体，受到相关病毒感染时，其ICAM-1表达上调[11-13]。

本试验研究结果提示：无论是高滴度或是低滴度噬菌体D29对气道上皮细胞分泌的IL-6、IL-8及气道上皮细胞的生长活性和ICAM mRNA 的分泌均无明显影响，表明噬菌体D29本身不会刺激气道上皮细胞发生炎症反应，初步表明噬菌体D29对气道上皮细胞具有较好的安全性，但本试验仅限于体外试验，对体内试验是否安全需要进一步动物试验证明。

综上所述，噬菌体D29作用于人气道上皮细胞一段时间过后，对其生长及功能均无明显影响，表面噬菌体D29对气道上皮细胞有较好的安全性，为今后噬菌体生物制剂通过呼吸道治疗肺结核感染提供安全性依据。

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Effects of different titers of bacteriophage D29 on growth and function of airway epithelia cell 9HTE*

LiangMei1,GuoShuliang2△,ZhangHongmei3

(1.DepartmentofRespiratory,People′sHospitalofYubeiDistrict,Chongqing401120,China; 2.DepartmentofRespiratory,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 3.DepartmentofRespiratory,theFifthPeople′sHospitalofChongqing，Chongqing400062,China)

Objective To research the effects of different titers of bacteriophage D29 on growth and function of airway epithelial cell 9HTE.Methods Cell viability rates was analyzed after applying high(109PFU/mL) and low(107PFU/mL) titers of bacteriophage D29 and phage buffer respectively by MTT colorimetry.Additionally,the secretion levels of IL-6，IL-8 in cell culture supernatant were detected by ELISA.RT-PCR was performed to detect the expression of ICAM-1 mRNA.Cell apoptosis rate was analyzed by flow cytometry.Results There was no difference in cell growth,secretion levels of IL-6,IL-8,ICAM-1 mRNA and cell apoptosis rate between cells treated with high and low titers of D29 and phage buffer(P>0.05).Conclusion Neither high nor low titer of bacteriophage D29 exerts effect on growth and function of airway epithelial cell 9HTE invitro.

bacteriophages；trachea；interleukins；vascular cell adhesion molecule-1；airway epithelial cells；security

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.15.003

国家自然科学基金资助项目(81570010)。作者简介：梁梅(1984-)，住院医师，硕士，主要从事呼吸系统疾病方面研究。△

，E-mail:guosl999@sina.com。

R329.2

A

1671-8348(2017)15-2024-03

2016-11-21

2017-01-09)