鹿中结核分枝杆菌最佳DNA提取方法探索

徐 娜，李 鑫，孙甸甸，徐亚维，尹 锐

(吉林农业科技学院 生物工程学院，吉林 吉林 132101)



鹿中结核分枝杆菌最佳DNA提取方法探索

徐 娜，李 鑫，孙甸甸，徐亚维，尹 锐

(吉林农业科技学院 生物工程学院，吉林 吉林 132101)

对树脂法、改良CTAB法和国标法三种方法获得的鹿中结核分枝杆菌DNA进行比较，通过核酸扩增鉴定和琼脂糖凝胶电泳分析，发现改良CTAB法获得的基因组DNA最佳，配合PCR技术检测灵敏度达到100 fg，且能对低含量样本进行快速检测。

鹿；结核分枝杆菌；DNA提取

鹿结核病是由结核杆菌引起的慢性、消耗性传染病，主要由牛型和人型结核分枝杆菌引起，临床症状为极度消瘦、呼吸困难，有的甚至瘫痪，死亡率高[1]。结核病一直以来也严重威胁着人类的生命健康，因此，快速诊断对预后和结核病疫情控制尤为重要[2]。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种快速特异的结核分枝杆菌检测方法，尤其适用于结核杆菌含量低的样品检测[3]。但PCR扩增诊断的高灵敏性和特异性要以高质量的结核分枝杆菌DNA的提取为前提。本文对鹿中分枝杆菌DNA提取的三种方法进行比较研究，探讨最佳提取方法，为从低含量结核分枝杆菌的样品中提取高质量DNA提供理论参考。

1 材料

1.1 试验动物及菌株

牛结核分枝杆菌菌株ATCC27289(BCG)(购自北京中原经贸公司ATCC菌种保存中心)。

1.2 主要试剂

聚合酶购于大连宝生物公司；溶菌酶、DNA分子量DL2000、DNTP购于上海生物工程有限公司。

1.3 主要仪器

微量快速紫外可见分光光度计(型号为BioSpec-nano，岛津)；电泳仪(型号为DYY-5，北京市六一)；凝胶成像仪(型号为Universal Hood Ⅱ型，BIO-RAD)；梯度PCR仪(型号为S1000，BIO-RAD)。

2 方法

2.1 DNA提取

培养后的BCG标准株菌落悬于PBS(pH 7.4)中，80℃灭活，12 000 r/min离心2 min，弃上清[4]。

2.2 改良CTAB法

样品悬于400 μL 10 mmol/L Tris-HCL和1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中灭活，加入10 μL 20 mg/mL蛋白酶K和30 μL 10% SDS，37 ℃孵育1 h，煮沸10 min[5]。加80 μL 1.8%高盐CTAB，65 ℃孵育10 min，加等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，12 000 r/min离心5 min。上清加0.6倍异丙醇，静止30 min，4 ℃，12 000 r/min离心5 min，TE回溶。

2.3 国标法

样品加100 μL提取液(pH 8.0 100 mmol/L Tris-HCL，0.01% Triton X-100) 和20 μL 10 mg/mL 蛋白酶K，56 ℃温浴30 min，98 ℃加热10 min，加等体积三氯甲烷，13 000 r/min离心5 min，上清用于PCR[4]。

2.4 树脂法

蒸馏水中加入玻璃球配制的含5% Chelex-100、1% Nonidet p-40和1% Tween-20的200 μL树脂悬浮液。100 ℃中保持30 min。13 000 r/min离心10 min，上清用作PCR[3]。

2.5 PCR鉴定灵敏度

以结核分枝杆菌复合群基因IS6110设计引物(F：5′-GCCGGA TCAGCGATCGT -3′；R：5′-GCAAA GTGTGGCTAACCCTGAA-3′)，将DNA初始浓度调到1×109，10倍连续梯度稀释至100 fg，分别扩增。 95 ℃预变性5 min，95 ℃变性1 min，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，2%琼脂糖凝胶鉴定[4]。

3 结果分析

3.1 紫外分光光度计鉴定

改良CTAB法其A260/A280的比值为1.83，接近纯DNA的光度比值(1.8～1.9)，且浓度也最高，达87.8 ng/μL；而国标法为1.38，树脂法为1.34，因此，CTAB法效果较好。

3.2 PCR鉴定

改良CTAB法检出信号随浓度降低呈均匀递减趋势(图1)，且最低检出限100 fg时的灵敏度也较高，说明改良CTAB法获取的DNA其PCR鉴定灵敏度较好。国标法随浓度降低检出信号急剧降低；树脂法检出信号不稳定且无浓度递减趋势，检出限只有1 pg，这与文献报道一致[5]。因此，改良CTAB法更好。

A：CTAB法；B：国标法；C：树脂法 M. DL 2000；1.10 ng；2.1 ng；3.100 pg；4.10 pg；5.1 pg；6.100 fg；7.control图1 三种方法提取的结核分枝杆菌DNA灵敏度的PCR结果Fig.1 PCR results of DNA sensitivity of mycobacterium tuberculosis extracted by three methods

4 结论

本研究将三种DNA提取方法的效率和运用于常规PCR检测的能力进行比较，结果只有改良CTAB法其A260/A280的比值介于1.8～1.9纯DNA的光度比值，且结合常规PCR鉴定表明，改良CTAB法更具有优势，更适合于标本量较小和含量较低的临床样本检测。

[1] Amin I，Idrees M，Awan Z，et al. PCR could be a method of choice for identification of both pulmonary and extra-pulmonary tuberculosis[J]. BMC Research Notes，2011，(04)：332-337.

[2] 方梅，陆巧荣，洪志强.分子信标荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌方法建立及其临床应用[J]. 四川大学学报(医学版)，2010，41(1)：162-165.

[3] Al-Mutairi NM，Ahmad S，Mokkadas E. Performance comparison of four methods for detecting multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains[J]. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease，2011，15(1)：110-115.

[4] Soolingen DV，Haas PE，Hermans PW，et al. Comparison of various repetitive DNA elements as genetic markers for strain differentiation and epidemiology of Mycobacterium tuberculosis[J]. Journal of Clinical Microbiology，1993，31(8)：1987-1995.

[5] Almeida IN，Carvalho WS，Rossetti ML，et al. Evaluation of six different DNA extraction methods for detection of Mycobacterium tuberculosis by means of PCR IS6110:preliminary study[J]. BMC Research Notes，2013，(06)：561-567.

Study on optimum DNA extraction of mycobacterium tuberculosis in deer

XU Na,LI Xin,SUN Dian-dian,XU Ya-wei,YIN Rui

(Jilin Agricultural Science and Technology University,School of Bioengineering,Jilin 132101,China)

Three DNA extraction methods including resin method,improved CTAB method and national standard method were employed in obtaining DNA of mycobacterium tuberculosis in the deer respectively,followed the appraisal of amplification and agarose gel electrophoresis analysis. The results show that improved CTAB method can gain the highest result and quickly identify mycobacterium tuberculosis of the samples with low content along with the detection sensitivity of 100 fg.

Deer; Mycobacterium tuberculosis; DNA extraction

2017-01-19

吉林省科技厅自然科学基金项目(20140101021JC)；国家级大学生科技创新科研项目(吉农院合字2016第049号)

徐娜(1995-)，女，本科。

尹锐(1981-)，男，讲师，硕士，e-mail：542977965@qq.com。

R450

A

1674-8646(2017)06-0172-02