食管胃结合部腺癌中RAD51蛋白的表达及临床意义

闫静波，卫 茹，李永才，李 辉，窦 艳，刘钟歆，陈江伟

食管胃结合部腺癌中RAD51蛋白的表达及临床意义

闫静波1，卫 茹2，李永才3，李 辉4，窦 艳1，刘钟歆1，陈江伟1

目的 探讨RAD51蛋白在食管胃结合部腺癌中的表达及临床意义。方法 采用免疫组化和Western blot法检测141例正常胃黏膜、112例胃黏膜上皮内瘤变及141例食管胃结合部腺癌中RAD51蛋白的表达，并分析其表达与食管胃结合部腺癌的临床病理学征特的关系。结果 免疫组化检测RAD51蛋白在正常胃黏膜组、低级别瘤变组、高级别瘤变组、食管胃结合部癌组织中的阳性率分别为8.51%、20.45%、44.12%和72.34%(P<0.05)；Western blot检测结果分别为1、2.29±0.08、4.97±0.24、8.13±1.03(P<0.05)，提示RAD51蛋白表达为逐渐升高的趋势。RAD51蛋白表达与食管胃结合部腺癌的病理分化程度、Lauren分型及有无淋巴结转移相关(P<0.05)。结论 RAD51在食管胃结合部腺癌的发生、发展过程中起重要作用。

食管胃结合部肿瘤；腺癌；上皮内瘤变；RAD51；Western blot

食管胃结合部腺癌(adenocarcinoma of esophagogastric junction, AEGJ)在河北省南部发病率较高。AEGJ最常用的分型是Siewert分型[1]：肿瘤中心位于胃食管交界(esophagogastric junction, EGJ)及上下各5 cm范围内的腺癌为AEGJ，AEGJ分为三种类型：SiewertⅠ～Ⅲ型，Ⅱ、Ⅲ型相对多见，Ⅰ型相对少见[2]。RAD51是一种DNA双链断裂修复蛋白，在同源重组修复中起重要作用。RAD51蛋白及其DNA和mRNA水平的改变，能够影响肿瘤发生、发展及其生物学行为。RAD51蛋白低表达，会造成胚胎死亡；RAD51蛋白适量表达，能修复自发性的DNA损伤；然而，RAD51蛋白过表达，能促进肿瘤的发生、发展，增强肿瘤对放、化疗的耐受性[3]。本实验采用免疫组化和Western blot法检测RAD51蛋白在AEGJ组织中的表达，探讨RAD51蛋白在AEGJ中表达的意义。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2005～2015年河北医科大学附属邢台市人民医院病理科存档的141例AEGJ标本，并且均经一位病理副主任医师初诊和一位病理主任医师复诊。另选取141例正常胃黏膜和112例胃黏膜上皮内瘤变作为对照。141例AEGJ患者术前未行放、化疗，男性93例，女性48例；年龄<50岁者56例，≥50岁者85例；肿瘤最大直径<4 cm者78例，≥4 cm者63例；组织学分化：高分化50例，中+低分化91例；Lauren分型：肠型85例，弥漫型56例；癌组织侵犯：黏膜层或黏膜下层(早期胃癌)32例，侵及肌层或浆膜层(中晚期胃癌)109例；无淋巴结转移者81例，淋巴结转移者60例；SiewertⅠ型6例，SiewertⅡ型71例，SiewertⅢ型64例。112例胃黏膜上皮内瘤变中低级别上皮内瘤变44例，高级别上皮内瘤变68例。141例胃黏膜均取自胃癌标本距肿物5 cm远的正常黏膜。以上3组标本，分为两份：一份经10%中性福尔马林固定，行HE和免疫组化染色；另一份放入液氮冻存，行Western blot检测。

1.2 免疫组化 RAD51单克隆抗体购于美国Santa Cruz公司，浓度为1 mg/mL，按照1 ∶300进行稀释。免疫组化染色采用EnVision两步法。RAD51蛋白表达定位于胞质和胞核。(1)根据着色强度计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。(2)根据阳性细胞占总细胞数百分比计分：阳性细胞数﹤10%为0分，10%～24%为1分，25%～49%为2分，50%～74%为3分，≥75%为4分。将两项得分结果相乘：0～1分为(-)，≥2分为(+)。

1.3 Western blot法 提取AEGJ组的蛋白，参照蛋白标准曲线测定蛋白含量，做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶内的样品蛋白转移至硝酸纤维膜上，5%BSA常温振荡封闭1 h。一抗(RAD51抗体)4 ℃过夜，二抗室温1 h。然后加入碱性磷酸酶显色剂显色20 min。用扫描仪扫描硝酸纤维素膜上蛋白表达条带的灰度，用自动图像分析系统进行定量分析，正常胃黏膜组的平均光密度值(OD值)取值为1，其它各组与正常胃黏膜组相比取值。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计学处理，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化法检测RAD51的表达 RAD51蛋白在正常胃黏膜组、低级别上皮内瘤变组、高级别上皮内瘤变组和AEGJ组的阳性率逐渐增高(P<0.05，表1，图1)。

表1 黏膜组、瘤变组、腺癌组中RAD51的表达

ABCD

图1 RAD51在正常胃黏膜组(A)、上皮内瘤变组(B)、高分化腺癌(C)和低分化腺癌(D)中的表达，EnVision两步法

2.2 Western blot法检测RAD51的表达 Western blot结果显示：RAD51蛋白表达在正常胃黏膜组、低级别瘤变组、高级别瘤变组、食管胃结合部癌分别为1、2.29±0.08、4.97±0.24、8.13±1.03，RAD51蛋白的表达逐渐升高(P<0.05，图2)。

图2 Western blot法检测RAD51的表达

1.正常胃黏膜组；2.低级别上皮内瘤变组；3.高级别上皮内瘤变组；4.食管胃结合部腺癌组

2.3 RAD51表达与AEGJ临床病理特征的关系 实验结果显示，RAD51表达与患者年龄、性别、侵犯深度、肿瘤大小及Siewert分型无关(P>0.05)。RAD51表达与AEGJ病理分化程度、Lauren分型及有无淋巴结转移相关(P<0.05)。RAD51蛋白在中+低分化胃腺癌中的表达高于高分化胃腺癌(图1)；Lauren分型中，RAD51蛋白在弥漫型胃腺癌的表达高于肠型胃腺癌；RAD51蛋白在有淋巴结转移胃腺癌中的表达高于无淋巴结转移胃腺癌(表2)。

表2 RAD51表达与食管胃结合部腺癌临床病理特征的关系

3 讨论

AEGJ即肿瘤位于EGJ上下5 cm范围内的腺癌，过去被称为胃上部癌。近年来，胃窦癌发病率呈下降趋势；然而，AEGJ的发病率却持续升高。AEGJ进展快，预后较差，约80%的AEGJ发现时已为晚期，AEGJ的5年生存率﹤30%[4]，与胃窦癌相比，AEGJ较早深层胃壁浸润、转移及复发[5-6]。AEGJ最常用的分型为Siewer分型，可分为三种类型：SiewertⅠ型：即EGJ，肿瘤的中心位于EGJ以上1～5 cm距离，以往称为食管下段腺癌；SiewertⅡ型，即肿瘤的中心位于EGJ上1 cm到下2 cm的距离，以往称为贲门癌；Siewert Ⅲ型，即肿瘤中心位于EGJ下2～5 cm的距离，过去称为贲门下癌或胃底癌。SiewertⅠ型预后最好，SiewertⅡ型次之，SiewertⅢ型最差。在西方国家，这三种类型的发病率基本相同；在我国SiewertⅠ少见，而SiewertⅡ和Ⅲ多见。肖文光等[7]的研究结果显示，我国SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型所占比例分别为3.9%、53.1%和43.0%；杨宏等[8]的研究结果显示，我国SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型所占比例分别为4.7%、50.3%和45.0%。本组141例AEGJ中，SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型分别为6、71、64例，所占比例分别为4.3%、50.3%、45.4%，结果与文献[7-8]报道基本一致。

RAD51蛋白是一种DNA双链断裂修复蛋白，在同源重组修复中起重要作用，参与DNA损伤感应和细胞周期关卡的复杂信号通路，通过同源重组修复，RAD51蛋白可以保护细胞免受DNA损伤[9]。然而，过多的RAD51蛋白又会过量的刺激同源重组以及姐妹染色体的交换，结果会引起基因的不稳定性以及遗传的差异，调节肿瘤细胞增殖以及信息传递，结果引起瘤细胞明显的增生失控以及分化成熟障碍，从而导致肿瘤的发生，并造成肿瘤细胞对放、化疗耐药和预后不良[10]。RAD51蛋白有两个关键肽段，也是目前研究较多的抑癌基因产物，即191-220以及231-260，与其对应的序列分别为YARAFNTDHQTQLLYQASAM-MVESRYALLI以及DYSGRGELSARQMHLARFLRMLLRLADEFG[11]。RAD51蛋白的一些关键氨基酸如果发生突变，就会引起该基因的失活，结果引起肿瘤形成。RAD51蛋白在多种肿瘤中高表达，如乳腺肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤以及膀胱肿瘤等[12]。

本组免疫组化和Western blot检测结果显示，RAD51蛋白在正常胃黏膜组、低级别上皮内瘤变组、高级别上皮内瘤变组和AEGJ组中的表达逐渐升高(P<0.05)；RAD51蛋白在中+低分化胃腺癌中的表达强于高分化胃腺癌。结果显示，RAD51蛋白在正常胃黏膜、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、高分化腺癌、低分化腺癌中的表达逐渐升高，说明RAD51蛋白可能促进食管胃结合部黏膜的癌变以及肿瘤的发生、发展。

本组实验显示，RAD51蛋白表达与患者年龄、性别、侵犯深度、肿瘤大小及Siewert分型无关(P>0.05)；RAD51蛋白表达与AEGJ病理分化程度、Lauren分型以及有无淋巴结转移相关(P<0.05)，RAD51蛋白在中+低分化胃腺癌的表达高于高分化胃腺癌；Lauren分型中，RAD51蛋白在弥漫型胃腺癌的表达高于肠型胃腺癌；RAD51蛋白在有淋巴结转移胃腺癌中的表达高于无淋巴结转移的胃腺癌，这说明RAD51可能与AEGJ分化程度、发生发展、预后有一定的关系，其可能是判断肿瘤恶性程度高低及分级、分期的重要标志。随着肿瘤的进展，恶性程度的增高，RAD51蛋白表达升高，提示RAD51蛋白可能促进AEGJ的发生、发展。RAD51蛋白在有淋巴结转移组中的表达升高，提示RAD51蛋白可能促进了AEGJ的淋巴结转移，有淋巴结转移的患者预后则差，因此，RAD51蛋白的表达水平能够作为判断AEGJ患者预后的参考指标。弥漫型胃腺癌RAD51蛋白表达高于肠型胃腺癌，弥漫型胃腺癌主要包括低分化腺癌及印戒细胞癌，恶性程度相对较高，预后较差，而肠型胃腺癌主要指高分化腺癌，恶性程度相对较低，预后较好，仍然提示RAD51蛋白在低分化胃腺癌中表达高，RAD51蛋白可能促进了肿瘤的发生、发展，RAD51蛋白升高，患者预后较差。Raderschall等[13]的研究结果显示，如果肿瘤细胞内RAD51蛋白升高，肿瘤细胞对化疗药物和电离辐射敏感性降低；如果肿瘤细胞RAD51蛋白降低，癌细胞对放、化疗敏感性升高[14]。RAD51蛋白在肿瘤细胞内表达升高可造成肿瘤细胞基因组不稳定及肿瘤细胞对放、化疗不敏感。以RAD51为治疗靶点，蛋白质组学与基因治疗技术相结合的技术，能够提高肿瘤细胞对放、化疗的敏感性，有可能成为肿瘤治疗的新方法。

综上所述，RAD51蛋白在正常胃黏膜、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、高分化腺癌、低分化腺癌中表达逐渐升高，说明RAD51蛋白可能与胃黏膜的癌变、AEGJ的发生、发展有一定关系。RAD51蛋白表达与AEGJ病理分化程度、Lauren分型及有无淋巴结转移有关，实验推测RAD51与AEGJ的生物学行为及患者预后密切相关。深入探讨RAD51蛋白在AEGJ中的表达，为临床治疗寻找新的有效途径。

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1河北省邢台市人民医院病理科、3影像科、4外科，邢台 0540012河北省邢台市医学高等专科学校，邢台 054000

闫静波，男，硕士研究生，副主任医师。E-mail: yanjingbo2012@163.com

时间：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.020.html

R 735.2

A

1001-7399(2017)04-0439-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.020

接受日期：2016-12-15