胆管细胞癌中CtBP1、Zeb1、Zeb2与E-cadherin蛋白的表达及临床意义

胡 洁，边立会，王晓玉，杨月丽，张小玲，肖胜军

胆管细胞癌中CtBP1、Zeb1、Zeb2与E-cadherin蛋白的表达及临床意义

胡 洁1，边立会2，王晓玉2，杨月丽2，张小玲3，肖胜军4

目的 探讨转录抑制因子Zeb1、Zeb2、转录辅抑制因子CtBP1及其靶基因E-cadherin在胆管细胞癌中的表达及CtBP1、E-cadherin的临床意义。方法 采用免疫组化法检测胆管细胞癌及癌旁组织芯片中CtBP1、Zeb1、Zeb2和E-cadherin的表达。结果 CtBP1在胆管细胞癌及癌旁组织中的阳性率分别为44.44%和17.86%，Zeb2分别为34.92%和10.71%，E-cadherin分别为50.79%和100%，组间差异均有统计学意义(P均<0.05)。Zeb1在胆管细胞癌仅1例表达，而在癌旁组织中不表达。CtBP1与胆管细胞癌的分化程度相关(P<0.05)，E-cadherin与胆管细胞癌的分化程度及远处转移有关(P均<0.05)。E-cadherin和CtBP1及Zeb2表达呈负相关(r=-0.034、-0.029，P均<0.001)，CtBP1和Zeb2表达呈正相关(r=0.228，P=0.005)。结论 胆管细胞癌中CtBP1、Zeb2与E-cadherin均表达异常，CtBP1、Zeb2可能共同参与E-cadherin表达调控。联合检测CtBP1和E-cadherin有望成为评估胆管细胞癌恶性生物学行为的参考指标。

肝肿瘤； 胆管细胞癌；Zeb1；Zeb2；羧基末端结合蛋白1；E-cadherin

胆管细胞癌(cholangiocarcinoma)是一种起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，近年来国内发病率及病死率呈上升趋势，其恶性程度高，预后欠佳[1]。这与肿瘤术后局部复发和远处转移发生率较高密切相关。因此，探讨胆管细胞癌侵袭转移的机制，为临床诊断、合理治疗提供理论支持，具有非常积极的意义。肿瘤的侵袭及转移依赖于细胞的黏附、运动和变形，而这些作用源于肌动蛋白丝的分解、细胞与细胞间黏附的失活和肌动蛋白聚合之间的调整。上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)是一种重要的细胞黏附分子，其介导的黏附连接的破坏是细胞解离和分离的初始步骤，因此，研究E-cadherin抑制的基本过程被认为对肿瘤预防和迁移的抑制作用有重大意义[2]。Zeb蛋白即E盒结合锌指蛋白，是序列特异性DNA结合转录因子，其家族成员包括Zeb1和Zeb2。Zeb蛋白作为转录抑制因子能招募羧基末端结合蛋白(C-terminal binding protein, CtBP)，脊椎动物的CtBP基因编码CtBP1和CtBP2两种蛋白，其中CtBP1能与组蛋白去乙酰化酶相互作用，通过靶向结合启动子区域抑制基因表达[3]。CtBP1、Zeb及E-cadherin在胆管细胞癌中的表达及相互关系国内外鲜有报道，本实验采用免疫组化法检测CtBP1、Zeb1、Zeb2及E-cadherin在胆管细胞癌及癌旁组织中的表达，初步探讨其临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2007～2014桂林医学院附属医院手术切除的胆管细胞癌标本63例，其中男性34例，女性29例，有淋巴结转移者17例，无淋巴结转移者46例。患者年龄35～87岁(平均57.6岁)。高分化腺癌20例，中+低分化腺癌43例。患者术前均未行放、化疗。鼠抗人CtBP1单克隆抗体(浓缩型，1 ∶100稀释，Santa Cruz公司)；Zeb1及Zeb2(浓缩型，1 ∶100稀释，Sigma Aldrich公司)；E-cadherin(浓缩型，1 ∶50稀释，Santa Cruz公司)；二抗免疫组化检测试剂盒购于北京中杉金桥公司。

1.2 方法

1.2.1 组织芯片制备 镜下观察HE切片，选取2个肿瘤组织区域和1个癌旁组织区域并标记，然后通过组织芯片制作机细针打孔的方法在供体组织蜡块上采集组织，并转移至空白蜡块的阵列孔中，每个孔芯直径1.5 mm，制作组织芯片蜡块1个，蜡块含有155个点(1个为标志点)。

1.2.2 免疫组化 组织芯片蜡块4 μm厚连续切片，60 ℃烤片1 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，高温高压热修复，其他步骤按试剂盒说明书进行，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，脱水透明封固。以PBS代替一抗作阴性对照。

1.2.3 结果判读 由两位病理科主治以上的医师采用双盲法独立阅片，评判标准根据染色强度和阳性细胞百分比来判定。CtBP1：>75%的细胞核棕黄色为阳性；Zeb1：>25%的细胞核着色为阳性；Zeb2：>25%的细胞质及细胞核着色为阳性；E-cadherin：>25%的细胞膜完整着色为阳性。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学处理，胆管细胞癌与癌旁组织中各蛋白的阳性率之间的关系及CtBP1、E-cadherin与各临床指标的相关性采用四格表Pearson χ2检验，胆管细胞癌中各蛋白表达的关联性比较采用Pearson相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CtBP1、Zeb1、Zeb2和E-cadherin在胆管细胞癌和癌旁组织中的表达 CtBP1在细胞核中表达，胆管细胞癌及癌旁组织中的阳性率分别为44.44%、17.86%；Zeb2在细胞质及细胞核中表达，胆管细胞癌组织及癌旁组织的阳性率分别为34.92%、10.71%；E-cadherin在细胞膜及细胞质中表达，胆管细胞癌组织及癌旁组织的阳性率分别为50.79%、100%，差异均具有统计学意义(P均<0.05)；Zeb1在细胞核中表达，胆管细胞癌组织仅1例阳性，癌旁组织中不表达，差异无统计学意义(P>0.05，表1，图1～3)。

2.2 胆管细胞癌中CtBP1及E-cadherin蛋白表达的临床意义 胆管细胞癌组织中CtBP1蛋白的表达与分化程度相关，高分化胆管细胞癌的阳性率为20%，而中+低分化胆管细胞癌的阳性率高达69.77%，两者之间的差异有统计学意义(P=0.009)，但其与患者年龄、性别、肿瘤大小、神经侵犯、脉管浸润、淋巴结转移及远处转移无明显相关性。E-cadherin蛋白表达与胆管细胞癌组织分化程度及远处转移相关(P=0.005，P=0.038)，与其他临床特征无明显相关性(表2)。

①A①B①C②A②B②C③A③B③C

图1 A.癌旁组织胆管上皮中CtBP1阴性；B.高分化胆管细胞癌中CtBP1细胞核弱阳性；C.中低分化胆管细胞癌中CtBP1细胞核强阳性，SP法 图2 A.癌旁组织胆管上皮中E-cadherin细胞膜及细胞质阳性；B.高分化胆管细胞癌中E-cadherin部分细胞膜及细胞质阳性；C.中低分化胆管细胞癌中E-cadherin阴性，SP法 图3 A.癌旁组织胆管上皮中Zeb2阴性；B.高分化胆管细胞癌中Zeb2细胞质及细胞核弱阳性；C.中低分化胆管细胞癌中Zeb2细胞质及细胞核强阳性，SP法

表1 CtBP1、Zeb1、Zeb2和E-cadherin在胆管细胞癌与癌旁组织中的表达

表2 CtBP1及E-cadherin蛋白表达与胆管细胞癌临床病理特征的关系

2.3 胆管细胞癌中CtBP1、Zeb2和E-cadherin表达的关系 胆管细胞癌组织中28例CtBP1阳性者中仅7例E-cadherin阳性(25%)；CtBP1阴性病例中E-cadherin阳性率为71.43%(25/35)，两者表达呈显著负相关(rs=-0.034，P<0.001，表3)。胆管细胞癌组织中Zeb2阳性病例中CtBP1阳性率为68.18%(15/22)，Zeb2阴性病例中CtBP1阳性率为7.31%(13/41)，两者表达呈高度正相关(rs=0.228，P=0.005，表4)；胆管细胞癌组织中Zeb2阳性病例中仅4例(18.18%)E-cadherin阳性，Zeb2阴性病例中E-cadherin阳性率为68.29%(28/41)，两者表达呈显著负相关(rs=-0.029，P<0.001，表5)。

表3 胆管细胞癌中CtBP1和E-cadherin蛋白表达的相关性

表4 胆管细胞癌中CtBP1和Zeb2蛋白表达的相关性

表5 胆管细胞癌中Zeb2和E-cadherin蛋白表达的相关性

3 讨论

E-cadherin普遍存在于各类上皮细胞，参与细胞的凝聚力并在相同或不同类型细胞的组织结构重建和形态维持中起关键作用。大量研究发现E-cadherin具有抑制肿瘤浸润转移的作用[4]，其表达缺失能增加肿瘤的侵袭能力[5]。Araki等[6]发现E-cadherin表达下调能够促进肝外胆管癌的发展，并与患者预后相关。本实验结果显示，跟癌旁组织比较，胆管细胞癌中E-cadherin蛋白表达明显下调或缺失，并且与分化程度及远处转移相关，分化程度较低或伴有远处转移的胆管细胞癌中E-cadherin蛋白阳性率较低，差异具有统计学意义，综合数据分析表明E-cadherin蛋白表达的下调或缺失促进了胆管细胞癌的浸润和转移，这与文献报道一致[5]。实验数据显示E-cadherin蛋白在无淋巴结转移组的阳性率高于伴淋巴结转移组，但差异无统计学意义(P=0.085)，可能是由于研究样本量较小的原因。

E-cadherin的编码基因CDH1的表达受多个转录抑制因子的调控，包括Snail、Zeb等[7]，Zeb蛋白家族成员Zeb1及Zeb2都含有螺旋-环-螺旋基序，可以特异性地结合到 E-cadherin基因启动子区域内的E-box上，从而参与调控E-cadherin的表达[8]。有报道称[9-10]在多种肿瘤细胞中Zeb1及Zeb2可抑制E-cadherin的表达，其中Zeb1与转录辅助抑制因子CtBP1结合，形成转录抑制复合物，从而抑制E-cadherin转录[10]。而Zeb2通过结合E-cadherin基因启动子的E-box抑制其表达，从而促进肿瘤细胞的浸润转移[11]。本组实验结果显示，在胆管细胞癌中Zeb2和CtBP1蛋白表达明显上调，且与E-cadherin蛋白表达呈显著负相关，Zeb2和CtBP1可能共同作用参与胆管细胞癌E-cadherin蛋白表达调控并抑制其表达，从而促进胆管细胞癌的浸润转移，其具体的作用机制有待于进一步深入研究。曾思恩等[12]曾报道CtBP1与肝细胞肝癌的分级相关，可作为肿瘤的预后因子。本实验结果显示CtBP1蛋白表达与胆管细胞癌的分化程度相关，肿瘤分化程度越低CtBP1蛋白的表达越高，也进一步提示CtBP1蛋白跟胆管细胞癌的恶性程度相关，但CtBP1蛋白表达与淋巴结转移和远处转移无关，这可能与本组实验样本量较少有关，此外，还受病理科医师取材能力及影像学诊断水平等主观因素的影响。

Zeb1在癌旁组织中不表达，在胆管细胞癌中也仅有1例表达，两者表达差异无统计学意义。作者推测Zeb1和Zeb2虽然在分子结构高度相似，但它们的表达量和功能上存在着一定的差异[8]。

综上所述，CtBP1、Zeb2在胆管细胞癌中表达上调，两者之间呈显著正相关，并均与E-cadherin表达呈负相关，三者之间存在调控关系，共同促进胆管细胞癌的浸润转移；且CtBP1和E-cadherin均与胆管细胞癌分化程度相关，后者还与远处转移相关，联合检测CtBP1和E-cadherin有望成为评估胆管细胞癌恶性生物学行为的参考指标。

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Expression of CtBP1, Zeb1, Zeb2 and E-cadherin in cholangiocarcinoma and their clinical significance

HU Jie1, BIAN Li-hui2, WANG Xiao-yu2, YANG Yue-li2, ZHANG Xiao-ling3, XIAO Sheng-jun4
(1DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541001,China;2GraduateSchoolofGuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China;3DepartmentofPhysiology,FacultyofBasicMedicalSciences,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China;4DepartmentofPathology,theSecondAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541199,China)

Purpose To investigate the expression of transcriptional suppressor CtBP1, Zeb1, Zeb2 and their target gene E-cadherin, and their significance in cholangiocarcinoma. Methods The expression of CtBP1, Zeb1, Zeb2 and E-cad- herin proteins in cholangiocarcinoma and the paired non-neoplastic tissue array were detected by the immunohistohemical staining. Results The positive rates of CtBP1 expression in cholangiocarcinoma and the paired non-neoplastic tissue were 44.44% and 17.86%, these of Zeb2 were 34.92% and 10.71%, and these of E-cadherin were 50.79% and 100%, respectively. The differences between the groups were statistically significant (allP<0.05). There was only one case with expression of Zeb1 in cholangiocarcinoma, but no expression in the paired non-neoplastic tissue. CtBP1 was correlated with the degree of differentiation of cholangiocarcinoma (P<0.05). E-cadherin was related to the differentiation degree , and distant metastasis of cholangiocarcinoma (allP<0.05). The E-cadherin expression was negatively correlated with CtBP1 and Zeb2 (r=-0.034, -0.029, allP<0.05). The Zeb2 expression was positively correlated with CtBP1 (r=0.228,P=0.005). Conclusion CtBP1, Zeb2 and E-cadherin express abnormally in cholangiocarcinoma. CtBP1, Zeb2 may be involved in the regulation of E-cadherin expression. Joint detection of CtBP1 and E-cadherin is expected to be a reference index to evaluate the malignant biological behavior of cholangiocarcinoma.

liver neoplasms; cholangiocarcinoma; Zeb1; Zeb2; CtBP1; E-cadherin

国家自然科学基金(81660485)、广西壮族自治区和计划生育委员会资助课题(Z2015404)

1桂林医学院附属医院病理科，桂林 5410012桂林医学院研究生院，桂林 5410043桂林医学院基础医学院生理学教研室，桂林 5410044桂林医学院第二附属医院病理科，桂林 541199

胡 洁，女，主治医师。E-mail: 214736697@qq.com 肖胜军，男，教授，博士生导师，通讯作者。E-mail: xiaoshengjun@glmc.edu.cn

时间：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.003.html

R 735.8

A

1001-7399(2017)04-0365-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.003

接受日期：2017-02-07