β3肾上腺素能受体在大鼠缺血心肌中的表达△

丁洽烽，李玉光，潘红星，谭学瑞，陈永松

（汕头大学医学院第一附属医院，广东汕头515041）

β3肾上腺素能受体在大鼠缺血心肌中的表达△

丁洽烽，李玉光，潘红星，谭学瑞，陈永松

（汕头大学医学院第一附属医院，广东汕头515041）

目的探究β3肾上腺素能受体在大鼠缺血心肌中的表达。方法结扎大鼠冠状动脉建立心肌慢性缺血模型，应用免疫组化和Western blot检测β3受体在缺血后心肌中的表达及分布。结果免疫组化结果显示，与假手术组对比，手术组中慢性缺血心肌细胞有强β3受体蛋白表达信号，其分布不均一。Western blot提示，手术组大鼠心肌β3受体表达量明显高于假手术组，差异有统计学意义（P<0.001）。心肌组织中的微血管内皮细胞也有β3受体蛋白表达。结论大鼠慢性缺血心肌组织中的心肌细胞和心肌微血管内皮细胞β3受体表达增多。

β3肾上腺素能受体；心肌缺血；大鼠

β3受体的基因在很早就被成功克隆［1］，早期发现β3受体主要分布在白色和棕色脂肪组织，所以被认为跟心脏的关系不大。然而，近来的研究发现，在β3受体激动剂BRL37344的作用下，心脏可产生负性的变力作用，提示β3受体在心血管系统中有着重要的作用。近年来，有研究认为，β3受体对心脏有保护作用，但是有研究认为其促进心力衰竭的发展，这跟其在心脏中的表达分布是否有关尚不明确。有关慢性缺血心肌中β3受体蛋白表达分布的研究甚少，为此，我们在大鼠动物模型上对其表达及分布进行研究，为进一步研究其在心血管系统中的作用提供基础。

1 材料与方法

1.1 动 物

雌雄不限，健康Spreague-Dawley大鼠40只，体质量为（220±20）g。由汕头大学医学院实验动物中心提供。

1.2 动物模型的建立

大鼠随机分为手术组和假手术组，应用结扎冠状动脉的方法建立慢性心肌缺血模型。主要过程如下：大鼠称重，麻醉，阿托品皮下注射减少分泌物。麻醉药起效后将大鼠固定于实验台。大鼠行气管插管，连接小动物呼吸机，同时连接BL-420E生物机能实验系统，对其进行心电监护。手术部位剪毛、消毒、开胸，找到心脏后撕开心包膜，在左心耳和肺动脉圆锥之间结扎血管。假手术组只缝线、不结扎。手术完毕，用蘸有青霉素液的棉支涂擦创口，预防感染，鼓肺并迅速关胸。脱机后放回鼠笼饲养两个月。两个月后处死大鼠，取出心脏，一半用甲醛固定，一半存放于-80℃冰箱备用。

1.3 免疫组化方法

常规脱蜡，梯度酒精，3%的H2O2和抗原修复，封闭液封闭，用山羊抗大鼠一抗滴加后在4℃过夜。按S-P试剂盒的说明逐个加液，最后用二氨基联苯胺（DAB）显色。蒸馏水冲洗，苏木素复染，分化，脱水，封片。以磷酸盐缓冲液代替一抗做阴性对照，用脂肪组织做阳性对照。显示棕黄色为阳性颗粒。结果用NIKON拍照系统进行拍照。

1.4 Western blot方法

裂解液裂解，提取心肌组织蛋白，Bradford比色法测定浓度。等量上样，在12%的聚丙烯酰胺凝胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDSPAGE）凝胶电泳。蛋白质电转至硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭过夜。加入羊抗鼠β3受体的一抗进行杂交，再用辣根标记的兔抗山羊IgG二抗进行免疫反应。结果在图像分析系统中进行灰度峰值分析。

1.5 设备及试剂

BL-420E生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司），TKR-200C小动物呼吸机（江西特力麻醉呼吸设备有限公司），NIKON拍照系统。β3抗体购自Santa Cruz公司，S-P试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 缺血心肌的大体标本和镜下结构

本模型建立的是心肌慢性缺血病变，大体标本外观可以看到很明显的瘢痕形成，慢性心肌缺血明确。苏木素-伊红（HE）染色后对缺血区、边缘区和非缺血区分别进行镜下观察：梗死灶中坏死的心肌纤维逐渐被溶解吸收，残留部分肌膜，原心肌结构改变明显，主要为纤维组织代替而形成瘢痕。梗死灶周边为部分心肌溶解，有较多的巨噬细胞。可见内膜下部分免于坏死的心肌细胞仍存，仍可以看到变性后心肌细胞的基本结构。在非缺血区，心肌细胞代偿性肥大，横径增加，核增大，染色深，外形不规整。

2.2 β3受体在缺血心肌中的表达及分布

2.1.1 β3受体表达的免疫组化结果 在心肌细胞的胞膜上和胞浆里可见β3受体表达。心肌缺血后β3受体的表达明显增多，尤其是那些免于坏死纤维化的细胞和代偿性肥大的细胞表达增多更加明显，见图1。有趣的是，同在一个区域，有的细胞表达强，有的表达很弱，分布不均匀，见图2。

图1 心肌组织中β3受体免疫组化结果［（a）为假手术组（×20）；（b）为手术组（×20）；（c）为手术组高倍镜下所见（×100）。（d）（e）（f）为阴性对照］

图2 心肌组织中β3受体分布情况（×100）［（a）为脂肪组织，作为阳性对照；（b）为缺血心肌在高倍镜下所见，在同一个区域，有的细胞表达强，有的细胞表达很弱］

2.1.2 β3受体表达的Western Blot结果 结果显示，手术组可见明显的β3受体蛋白阳性条带，假手术组蛋白条带较弱。灰度分析显示，β3受体在缺血后心肌中的表达明显上调，结果详见表1。

表1 β3受体表达Western blot结果

2.1.3 β3受体在缺血心肌微血管中的表达 在心肌组织的免疫组化检测结果中，我们观察到缺血的心肌微小血管上也有β3受体表达，主要是表达在内皮，详见图3。

图3 心肌组织微小血管内皮β3受体的表达（×100）［（a）手术组；（b）假手术组；（c）（d）为空白对照］

3 讨 论

心肌缺血模型的建立方法有多种，不同方法建立的模型适用于不同的研究。开胸结扎冠状动脉复制心肌缺血模型的方法比较成熟、可靠。结扎后可见明显的缺血梗死区，镜下可见心肌变性坏死、纤维化和瘢痕代替。在非缺血梗死区肌纤维排列紊乱，不均匀肥大，细胞结构不完整，胞核增多，心肌间质增生。我们的实验结果显示，技术成熟后成功结扎大鼠冠状动脉所造的动物模型可用于心肌缺血的研究。

β3受体最开始是在啮齿动物的脂肪组织中发现的，后来在其他部位也有发现，认为其跟脂肪代谢，胃肠道和血管平滑肌的舒张调节等有关［2-4］。心脏存在β肾上腺素能受体家族，随着对肾上腺素能受体与心脏功能关系研究的深入，本来被认为跟心脏的关系不大的β3受体越来越为学者所重视。相关研究指出，心脏在选择性β3受体激动剂BRL37344作用下表现为负性的变力作用，这种负性心力作用在心力衰竭中可能有着重要的作用。研究发现，β3受体在心肌内膜、中膜、外膜上的分布没有差别［5］。在人的标本中，可以看到右心室心肌细胞上有β3受体表达在细胞膜上［6］。Gauthier等［7］报道正常心脏的心室就已经存在着功能性的β3受体。在大鼠心肌缺血后，我们采用免疫组化和Western blot方法从蛋白水平对β3受体进行定位定性研究。结果观察到β3受体表达在大鼠心肌细胞的胞膜上和胞浆里，这与文献报道只在胞浆表达的结果有所不同。这可能是由于动物模型、缺血的范围和程度等不同因素造成的。在缺血心肌组织的非梗死区，那些免于坏死纤维化的心室肌细胞上有大量的β3受体表达。有趣的是在同一个高倍镜下，能同时观察到强表达β3受体的心肌细胞旁边也有弱表达β3受体的心肌细胞，原因不明。假手术组大鼠心肌细胞上的β3受体表达甚弱。近年来有研究认为β3受体对心脏有保护作用［8］，但是也有研究认为其促进心力衰竭的发展［9］，也许这跟β3受体在心脏中的表达分布不均匀有一定的关系。

另外，我们也观察到心脏组织内的微小血管上有β3受体表达，主要集中表达在缺血心肌微血管内皮细胞上。微血管内皮有重要的作用，β3受体在缺血心肌微血管内皮表达增高的意义有待进一步的研究。

本实验建立慢性心肌缺血动物模型，检测结果表明，缺血心肌中β3受体表达上调、分布不均，这为进一步研究β3受体在心血管系统中的作用提供基础。

［1］EMORINE L，MARULLO S，BRIENDSUTREN M，et al. Molecular characterization of the human β3adrenergic receptor［J］.Science，1989，245（4922）：1118-1121.

［2］ARCH J R，KAUMANN A J.Beta 3 and atypical beta-adreno⁃ceptors［J］.Med Res Rev，1993，13（6）：663-729.

［3］INUKAI T，TAYAMA K，INUKAI Y，et al.Clinical features of a polymorphism of the beta 3-adrenergic receptor gene in patients with type 2 diabetes mellitus-A study using a pinpoint sequencing method［J］.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2001，109（7）：386-388.

［4］LOWE J，ROTIMI C，LUKE A，et al.The beta 3-adrenergic receptor gene and obesity in a population sample of African Americans［J］.Int J Obes Relat Metab Disord，2001，25（1）：54-60.

［5］MONIOTTE S，KOBZIK L，FERON O，et al.Upregulation of beta（3）-adrenoceptors and altered contractile response to inotropic amines in human failing myocardium［J］.Circulation，2001，103（12）：1649-1655.

［6］DE MATTEIS R，ARCH J R，PETRONI M L.Immunohisto⁃chemical identification of the beta（3）-adrenoceptor in intact human adipocytes and ventricular myocardium：effect of obesity and treatment with ephedrine and caffeine［J］.Int J Obes Relat Metab Disord，2002，26（11）：1442-1450.

［7］GAUTHIER C，TAVERNIER G，CHARPENTIER F，et al. Functional beta 3-adrenoceptor in the human heart［J］.J Clin Invest，1996，98（2）：556-562.

［8］NIU X，WATTS V L，CINGOLANI O H，et al.Cardioprotective effect of beta-3 adrenergic receptor agonism：role of neuronal nitric oxide synthase［J］.J Am Coll Cardiol，2012，59（22）：1979-1987.

［9］MASUTANI S，CHENG HJ，MORIMOTO F，et al.β3-Adrener⁃gic receptor antagonist improves exercise performance in pac⁃ing-induced heart failure［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2013，305（6）：H923-30.

Expression of beta 3 adrenergic receptors in rats with myocardial ischemia

DING Qia-feng，LI Yu-guang，PAN Hong-xing，TAN Xue-rui，CHEN Yong-song
（The First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College，Shantou，Guangdong 515041，China）

ObjectivesTo study the expression of β3adrenergic receptors in rats with myocardial ischemia.MethodsThe chronic myocardial ischemia model in rat was established by left coronary artery ligation.The expression and distribution of β3adrenergic receptors were detected by immunohistochemistry and Western blot.ResultsStrong staining of β3adrenergic receptor in myocardium cell was showed in operated group and the distribution was not uniform when compared with sham-operated group.The result of Western blot showed that the expression of β3adrenergic re⁃ceptor in operated group was significantly higher than that in Sham-operated group（P<0.001）.The β3adrenergic receptors could be also identified by immunohistochemistry in cardiac microvascular endothelial cells.ConclusionsExpression of β3adrenergic receptors increases in myocardial cells and cardiac microvascular endothelial cells in chronic myocardial ischemia.

β3adrenergic receptor；myocardial ischemia；rat

R542.2+2

：A

：1007-9688（2017）01-0089-04

10.3969/j.issn.1007-9688.2017.01.23

2016-06-06）

广东省科技计划项目（项目编号：2003C30613）

丁洽烽（1979-），男，在读博士研究生，研究方向为重症医学。