PCDH8基因启动子在前列腺癌组织及细胞中的甲基化测定及其临床意义①

齐文千,牛文斌

(佳木斯大学附属第一医院泌尿外科,黑龙江 佳木斯 154003)

PCDH8基因启动子在前列腺癌组织及细胞中的甲基化测定及其临床意义①

齐文千,牛文斌

(佳木斯大学附属第一医院泌尿外科,黑龙江 佳木斯 154003)

目的：检测PCDH8基因启动子在前列腺癌细胞PC3、DU145、LNCap及组织中的甲基化状态，并探讨其临床意义。方法：应用甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)检测42例前列腺癌组织，35例前列腺增生组织，前列腺癌细胞PC3、DU145、LNCap，人正常前列腺细胞RWPE-1、WPMY-1中PCDH8基因启动子甲基化情况，并分析临床资料。结果：甲基化存在于19例(19/42)前列腺癌患者组织以及全部3株前列腺癌细胞(3/3)中，而不存在于35例前列腺增生组织及2株正常前列腺细胞中(0/2)；并且甲基化与较高的Gleason评分，较高的术前PSA以及较高的病理分期相关。结论：前列腺癌中常出现PCDH8基因启动子甲基化，且与预后不良及更强的转移能力相关，有可能成为潜在的生物标记物。测定肿瘤组织中的PCDH8基因启动子甲基化状态可以有助于确定需要积极临床干预的患者来改善预后。

前列腺癌；PCDH8；DNA甲基化

前列腺癌是一种常见的实体恶性肿瘤，在美国等发达国家，长期占据着男性恶性肿瘤的第一位。目前，我们尚不能完全解释前列腺癌的发生发展机制，临床上大部分患者出现症状时已经进展到了中晚期。现在，在临床上广泛使用前列腺特异抗原(PSA)筛查前列腺癌，但是PSA也有局限性[1]，其检查结果可靠性不高，尚不能对前列腺癌的危险程度进行适当的评估。因此，我们就需要积极寻找新的具有特异性的标志物来帮助早期筛查前列腺癌，并评估预后。近些年，国内外学者普遍认为表观遗传学在肿瘤的发生发展中起着一定的甚至是至关重要的作用。表观遗传学是在不改变基因序列的前提下，通过DNA甲基化的改变，染色体重塑，组蛋白修饰等来调控基因的表达，贯穿肿瘤发生发展的整个过程[2]。其中研究较深入的是DNA甲基化，它的改变可以增加或者沉默相关基因的表达。近来PCDH8作为一种新型的抑癌基因得到关注，它可以在某些肿瘤发生启动子的高甲基化使基因表达减少甚至消失，来参与肿瘤的发生以及发展。PCDH8基因是原钙黏素基因家族中的一员，在介导细胞黏附，迁移，侵袭等方面都起着作用，进而影响肿瘤的发生发展[3]。其启动子异常高甲基化已经被证实存在于例如肾癌，膀胱癌等多种人类癌症中，被认为与较差的预后相关[3～5]，并可能独立预测前列腺癌患者的无生化复发生存时间[3]。然而，目前较少有关于前列腺癌组织及细胞中PCDH8基因启动子甲基化情况的报道，本研究以前列腺癌组织及细胞为研究对象，检测其PCDH8基因启动子甲基化状态，并分析其临床意义。

1 资料与方法

1.1 标本收集

收集2015-01～2016-06在佳木斯大学附属第一医院泌尿外科行前列腺癌根治术或经尿道前列腺电切术的前列腺癌患者和前列腺增生患者的术后标本，均经术后病理诊断证实。样品收集之后应用液氮快速冷冻，然后储存在-80℃冰箱中。

1.2 细胞培养

按照常规的细胞培养程序，人前列腺癌细胞PC3使用含15%胎牛血清的PRMI1640培养液，置于5%CO2，37℃恒温细胞培养箱中进行培养，人前列腺癌细胞DU145、LNCap培养基含10%胎牛血清，其他条件不变。人正常前列腺细胞RWPE-1、WPMY-1使用含10%胎牛血清的DMEM培养基。

1.3DNA提取及亚硫酸盐修饰

从冰箱中取出收集的样本，使用组织DNA提取试剂盒，按照说明书上的步骤提取组织DNA。取对数期细胞，使用细胞DNA提取试剂盒，按照操作步骤进行操作提取细胞DNA。用紫外分光光度仪检查，DNA浓度合格的标本-20℃保存备用。采用EZDNAMethylation-GoldKit(zymoresearch美国，货号：D5005) 进行亚硫酸氢盐修饰，经甲基化修饰后置于-20℃保存。

1.4 甲基化特异性PCR

以亚硫酸盐修饰后的DNA作为模板，使用已经报道的引物序列[3,4]，由生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成引物，具体引物序列见表1。之后分别进行PCR扩增。反应体系如下：12.5μLZymoTaqPreMix，2ul模板，上下游引物各1μL，ddH20补足至25μL。反应条件：95℃ 5min，1个周期预变性；94℃ 30s、退火 60℃ 30s、延伸 72℃ 30s，40个周期变性；72℃ 5min，1个周期。取10μLMSP扩增产物进行电泳，紫外灯下观察结果。甲基化正向存在条带记为阳性，条带只在未甲基化DNA出现的样品记为甲基化阴性[3,4]。

表1 MSP 中PCDH8 基因甲基化引物序列

1.5 统计学方法

采用SPSS17.0处理，用卡方检验或Fisher确切概率法进行分析。P<0.05差异具有统计学意义。

2 结果

①PCDH8基因启动子甲基化存在于全部3株人前列腺癌细胞中，且PC3和DU145甲基化程度略高于LNCap细胞，而在2株人正常前列腺细胞中均未发现存在甲基化(图1)。②检出存在PCDH8基因启动子甲基化的前列腺癌样本19例(19/42)，前列腺增生组织中均未发现甲基化的存在，两者之间差异存在统计学意义(P<0.01)(图2)。③分析19例存在PCDH8基因启动子甲基化与23例未发现甲基化的前列腺癌病例的临床资料。发现Gleason评分、术前前列腺特异性抗原(PSA) 和术后病理分期差异存在统计学意义，而年龄差异无统计学意义。见表2。

图1 细胞系中的MSP结果

图2 前列腺癌组织中PCDH8基因启动子甲基化具有代表性的MSP结果。M：甲基化;U：未甲基化。Pca1和Pca2为甲基化，Pca3为非甲基化

表2 42例前列腺癌患者的临床资料

3 讨论

进入新世纪以来，我国前列腺癌的发病率快速增长。现有的筛查方法PSA具有一定的局限性，寻找早期筛查前列腺癌，并评估风险的标志物就显得尤为重要。目前，科学家普遍认为除基因突变和染色质丢失外，第三种导致抑癌基因失活的机制是甲基化，有时甚至是唯一的机制[6]。DNA甲基化水平的变化，在前列腺癌中被认为出现相对较早，甚至是癌前病变阶段，可使用PCR方法检测，比较敏感，可能成为理想得生物标志物。所以一些基因，在正常组织中无甲基化，若出现异常的甲基化表现，即有肿瘤发生的可能性。

PCDH8基因位于人类染色体的13q14.3，它含有6细胞外钙黏蛋白结构域，一个跨膜结构域和胞质区[3]。国内外尚未有发现PCDH8基因启动子甲基化存在于完全正常的组织中的报道，但是在多种肿瘤组织中已经发现其存在启动子异常高甲基化，进而使基因表达沉默。本研究显示，PCDH8基因启动子甲基化较多的出现在前列腺癌组织及细胞中，而在前列腺增生组织及正常前列腺细胞中均未检测到甲基化。由此可以推断，PCDH8基因启动子甲基化不存在于正常前列腺或增生组织中，具有前列腺癌肿瘤特异性。因此我们有理由认为：PCDH8 基因启动子甲基化仅发生于前列腺癌组织中，再次证明了使用PCDH8基因启动子甲基化早期筛查前列腺癌的可能性。此外，我们比较了42例前列腺癌患者的临床资料与PCDH8基因启动子甲基化之间的关系，发现Gleason评分≥7分，术前PSA≥10ng/mL以及较高的术后病理分期与患者PCDH8甲基化显著相关，说明存在PCDH8基因启动子甲基化的患者，其危险等级相对更高，可能和患者的预后不良有关。这有助于我们筛选出患者，并给予更加积极的术后治疗以及随访。但由于实验时间较短，对所研究患者的长期随访不足，我们尚无法明确PCDH8基因启动子甲基化与前列腺癌患者预后的关系。

人前列腺癌细胞LNCap、DU145和PC3是常见的三种前列腺癌细胞系，其中实验中常认为LNCap具有前列腺癌早期特征，是早期雄激素依赖性前列腺癌，转移潜能相对较弱；而PC3和DU145具有雄激素非依赖性，其中PC3具有中等强度的转移潜能，而DU145则具有强大的转移潜能[7]。本实验首次验证了这三种前列腺癌细胞系中PCDH8基因启动子甲基化情况，实验结果显示，甲基化存在于全部三种细胞中，并且PC3和DU145的甲基化水平高于LNCap。因此，我们有理由推测较高的PCDH8基因启动子甲基化程度意味着较强的转移能力，这与认为其介导细胞黏附侵袭等作用的观点相一致。而转移是临床上实体肿瘤患者主要的死亡原因，所以更强的转移能力意味着需要更加积极的术后治疗以及随访，这也与我们前面提到的结论相一致。

本实验患者数少，并且缺乏长期的术后随访，使我们很难得出患者预后与PCDH8基因启动子甲基化水平的相关性，这些都将继续完善。此外，已有在血液样本中检测PCDH10基因启动子甲基化情况的相关报道[8]。我们也将尝试在血、尿等患者体液中检测PCDH8基因的启动子甲基化情况，为前列腺癌的早期筛查提供新的依据。

[1]马雷，辛华.血清总PSA、游离PSA检测在前列腺癌诊断中的临床应用[J].黑龙江医药科学，2007,30(2)：11-12

[2]TabyR,JPIssa.Cancerepigenetics[J].CA:acancerjournalforclinicians,2010,60(6):376-392

[3]NiuWB，SLGui，YLLin，etal.PromoterMethylationofProtocadherin8isanIndependentPrognosticFactorforBiochemicalRecurrenceofEarly-StageProstateCancer[J].MedSciMonit,2014,20

[4]LinYL,YLWang,JGMa,etal.Clinicalsignificanceofprotocadherin8 (PCDH8)promotermethylationinnon-muscleinvasivebladdercancer[J].JExpClinCancerRes,2014, 33:68

[5]MorrisMR，CJRicketts，DGentle，etal.Genome-widemethylationanalysisidentifiesepigeneticallyinactivatedcandidatetumoursuppressorgenesinrenalcellcarcinoma[J].Oncogene，2011,30:1390-1401

[6]JonesPA,PWLaird.Cancerepigeneticscomesofage[J].NatureGenet,1999,21:163-167

[7]林艳端，申锷，胡兵.三种常见的前列腺癌细胞系LNCap、PC3和DU145的生物学特性[J].中华临床医师杂志(电子版)，2013，7(11)：4980-4982

[8]吴旭鹏，郭玉刚，牛文斌.前列腺癌患者血清PCDH10 甲基化检测及临床意义[J].黑龙江医药科学，2016，39(4)：120-123

2016年佳木斯大学研究生科技创新项目，编号：YM2016_038。

齐文千(1990～)男，河北黄骅人，在读硕士研究生。

牛文斌(1972～)男，黑龙江佳木斯人，博士，副主任医师，硕士研究生导师。E-mail:niuwenbin@sina.com。

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1008-0104(2017)02-0052-02

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