枸杞枝条发酵木质纤维素降解与微生物群落多样性研究

冯海萍 杨冬艳 白生虎 谢 华 刘晓梅 裴红霞

(1.宁夏农林科学院种质资源研究所， 银川 750002; 2.固原市原州区农业技术推广服务中心， 固原 756000)

枸杞枝条发酵木质纤维素降解与微生物群落多样性研究

冯海萍1杨冬艳1白生虎2谢 华1刘晓梅2裴红霞1

(1.宁夏农林科学院种质资源研究所， 银川 750002; 2.固原市原州区农业技术推广服务中心， 固原 756000)

为探讨枸杞枝条基质化发酵中木质纤维素降解、微生物群落代谢能力及多样性特征，采用正交试验设计，以枸杞枝条粉和苦豆子茎秆粉质量比为4∶1混合为试材，采用Biolog-ECO鉴定方法，研究不同发酵因子对枸杞枝条基质化发酵中微生物群落结构和多样性的影响。结果表明：发酵结束时，枸杞枝条基质纤维素、半纤维素和木质素降解率分别在15%、19%及10%以上；木质纤维素降解率在温度为60℃、含水率为60%、添加油饼氮源及接种粗纤维素降解菌处理条件下较高，其中纤维素、半纤维素和木质素降解率分别在18.12%～19.22%、23.55%～25.21%和13.87%～14.24%范围内，显著高于其他处理；该处理增加了枸杞枝条基质发酵高温期时微生物的活性和多样性，平均颜色变化率分别为1.019、1.062、0.943和1.117，微生物多样性香浓指数、优势度指数和丰富度指数分别在2.321～2.365、0.930～0.941和18.78～20.33范围内，提高了枸杞枝条粉堆体中微生物对部分碳源的代谢能力，从而可促使有机质降解。

枸杞枝条粉； 木质纤维素； 降解； 微生物； 群落多样性； 平均颜色变化率

引言

农业废弃物资源化合理利用与管理是我国高度关注的农业和环境问题[1-2]。如何循环利用和产出农业废弃物资源是我国实现资源友好发展的关键节点，利用这些资源制作多样化、无害化园艺基质，不仅可以缓解环境污染与资源浪费问题，而且还为补充或替代当前不可再生资源的草炭基质提供原料来源，对保护环境和发展无土设施农业都大有益处。

宁夏现有枸杞种植面积达5.34万hm2以上，且逐年增加，据估算年剪枝量达20万t以上，但这些资源的应用仅局限于焚烧、废弃，少量的用于防沙造林或者插扦育苗，丰富的可再生枸杞资源需要后续产业的开发。从事栽培基质研究的学者已从微生物菌剂、碳氮比、氮源类型及比例对枸杞枝条粉基质化发酵的堆温、碳素、氮素、物理性状、生物学性状等指标进行了较多研究[3-5]，但对枸杞枝条发酵中木质纤维素降解及微生物群落多样性的研究鲜有报道。据测定，枸杞枝条粉富含97.30%木质纤维素，是牛粪堆肥中木质纤维素的1.38～1.86倍[6]，玉米秸秆的1.50倍，玉米芯的1.23倍，小麦秸秆的1.35倍，稻草的1.47倍[7]。木质纤维素的降解是限制堆肥(基质化)腐熟进程及影响堆肥产品品质的关键因素[8]，微生物群落种类的多样性及其代谢能力是影响堆肥中木质纤维素降解的关键因素[9-10]。文献[11-12]研究表明，在堆肥(基质化)过程中添加有机物或接种微生物菌剂对微生物群落活性、多样性及碳源的利用影响较大。Biolog 微平板法是一种分析堆肥过程中微生物群落活性、多样性及碳源利用的有效手段[12-14]。本文以枸杞枝条粉和苦豆子茎秆粉质量比4∶1混合为研究对象，在借助Biolog方法研究温度、含水率、外源菌剂及氮源对枸杞枝条基质化发酵中微生物群落的结构和功能多样性时，将碳源代谢利用情况与发酵基质中实际可利用碳源联系起来，以更好地了解枸杞枝条基质化发酵中木质纤维素的降解特性、微生物群落代谢能力及多样性特征，为枸杞枝条基质化整个体系进一步优化提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料来源及含量

本试验于2015—2016年在宁夏农林科学院园林场基质发酵场基地进行，试验材料有宁夏中宁枸杞枝条粉、苦豆子茎秆粉、鸡粪、油饼(胡麻榨完油后的渣滓压成饼)、堆肥发酵菌剂(粉剂，有效活菌总数在2×1010CFU/g以上)，粗纤维降解菌(粉剂，有效活菌总数在109CFU/g以上)，锯末专用复合菌(粉剂，有效活菌总数在2×108CFU/g以上)，其基本性质见表1。

表1 物料基本性质Tab.1 Basic properties of materials

1.2 试验设计

以粉碎长度0.3～0.5 cm枸杞枝条粉和苦豆子茎秆粉为主材料，质量比为4∶1进行混合，用鸡粪、油饼、尿素等辅料调节碳氮比至30∶1，试验采用L9(34)正交设计，设置了翻堆温度、含水率、氮源、微生物菌剂4个因素，每个因素设置3个水平，共设9个处理(表2)，每个处理设3次重复。将粉碎的枸杞枝条装入容积为1 m3的发酵池，用水洒湿，微生物菌按照粉末菌剂、麸皮质量比1∶10混合，然后按液料比0.005 mL/g分2次接种，第1次在发酵初始时接种，第2次在发酵10 d时结合翻料同时接种，初始含水率调节至65%，覆盖塑料薄膜进行发酵。

表2 枸杞枝条基质化发酵L9(34)正交试验设计Tab.2 Orthogonal design of L9(34) for wolfberry branches substrate fermentation experiment

温度设置3个水平，分别为翻堆上限温度70、60、50℃，当温度高于翻堆上限温度时进行翻堆；含水率设置3个水平，分别为60%、50%、40%，当基质含水率低于设置的基质含水率控制下限时，补充灌溉水至初始含水率的65%；微生物菌剂设置3个水平：锯末发酵菌剂、粗纤维降解菌和堆肥发酵菌剂；氮源设置3个类型：尿素、烘干鸡粪和油饼。

1.3 取样方法

发酵过程中，于第40天对发酵堆体取样，取样方法为：在物料翻堆前取每个重复的中心物料约250 g，装入无菌密封袋，待实验室测定用。

1.4 试验测定指标、方法及数据处理

(1)木质纤维素：采用FIBERTEC 2010型全自动纤维测定仪进行纤维素、半纤维素和木质素的测定[15]。

(2)微生物群落多样性：采用有31 种碳源的生态板(Biolog-ECO)分析微生物群落的代谢特征,称取10 g发酵基质(称量前测量含水率)，加入90 mL无菌生理盐水稀释，在摇床里振摇30 min，静置沉淀3～5 min, 然后进行100倍稀释，以每孔150 μL稀释液加入微孔板中，将制备好的菌悬液倒入无菌移液槽中，使用8道移液器将其接种于微平板的96孔中。接种好的微平板放到铺有6层纱布的塑料饭盒中，为防止微平板鉴定孔中的菌悬液挥发，纱布保持一定的湿度。塑料饭盒用保鲜膜包裹，保鲜膜上用注射针头刺若干个小孔，以保证微生物培养所需要的氧气，将微平板避光培养。ECO生态板放到30℃恒温培养。分别于24、48、72、96、120、168 h时读数，测定波长均为590 nm。

平均颜色变化率是反映土壤微生物代谢活性，即利用单一碳源能力的指标，计算公式[16]为

AWCD=∑(Ci-R)/n

式中Ci——第i个非对照孔的吸光度R——对照孔的吸光度n——培养基碳源种类数(本文取31)

(3)采用软件DPS 7.05和Excel 2003对试验数据进行方差及多重比较(Duncan 新复极差法)。

2 结果与分析

2.1 木质纤维素含量

由表3可以看出，与发酵前相比，处理的纤维素、半纤维素和木质素质量分数均低于处理前，各处理纤维素降解率均在15%以上，半纤维素降解率在19%以上，木质素降解率在10%以上。堆肥结束时，在不同翻堆温度中，翻堆温度60℃枸杞枝条粉发酵中的纤维素、半纤维素和木质素降解率较高，分别为18.12%、25.21%和13.87%，显著高于其他处理；在不同含水率管理中，含水率下限为60%枸杞枝条粉发酵中的纤维素、半纤维素和木质素降解率较高，分别为19.22%、25.21%和14.19%，显著高于其他处理；在接种不同微生物菌剂中，接种粗纤维素降解菌的枸杞枝条粉发酵中的纤维素、半纤维素和木质素降解率较高，分别为18.88%、23.55%和13.96%，与接种锯末发酵菌剂处理无显著差异，显著高于堆肥发酵菌剂处理；在添加不同氮源中，氮源为油饼枸杞枝条粉发酵中的纤维素、半纤维素和木质素降解率较高，分别为18.50%、23.59%和14.24%，与添加鸡粪氮源处理无显著差异，显著高于添加尿素氮源处理。说明适宜翻堆温度、含水率、接种微生物菌、添加氮源有利于枸杞枝条粉木质纤维素的降解，其中以温度为60℃、含水率为60%、添加油饼或鸡粪氮源及接种粗纤维素或锯末发酵菌效果较好。

表3 不同因素对枸杞枝条粉基质发酵中木质纤维素含量的影响Tab.3 Effects of different factors on cellulose content of wolfberry branche substrate in fermentation

注：不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著，下同。

2.2 平均颜色变化率

平均颜色变化率是表征微生物平均活性的一个指标，可以从功能代谢方面显示微生物群落结构多样性。由图1可看出，随着培养时间的延长，枸杞枝条基质微生物活性不断升高，自24 h 起平均颜色变化率迅速升高。对比不同翻堆温度、含水率、微生物菌及氮源类型枸杞枝条基质中微生物平均颜色变化率发现，翻堆温度处理枸杞枝条基质微生物平均颜色变化率的最大值从大到小依次为60、50、70℃，含水率处理枸杞枝条基质微生物平均颜色变化率的最大值从大到小依次为60%、50%、40%，微生物菌处理枸杞枝条基质微生物平均颜色变化率的最大值从大到小依次为粗纤维降解菌、锯末发酵菌剂、堆肥发酵菌剂，添加油饼氮源处理枸杞枝条基质微生物平均颜色变化率最大，添加尿素氮源处理杞枝条基质微生物平均颜色变化率最小，显著低于其他氮源类型。从不同处理枸杞枝条基质的平均颜色变化率变化可以看出，翻堆温度为60℃、含水率补充下限60%、接种粗纤维降解菌及添加油饼处理更有利于增加堆肥高温期时的微生物的活性，提高细胞代谢相关营养物质的能力。

图1 高温期枸杞枝条粉基质的微生物平均颜色变化率变化Fig.1 Average well color development variations of wolfberry substrate by microorganism

2.3 群落多样性分析

香浓指数、优势度指数、丰富度指数是研究群落物种数及其个体数和分布均匀程度的综合指标，可以从不同侧面反映微生物群落代谢功能的多样性[20]。本文采用这3个指数来研究枸杞枝条基质化发酵中高温期堆体微生物群落对31种碳源利用的多样性,不同处理枸杞枝条粉基质中香浓指数、优势度指数、丰富度指数如表4所示。由表4可以看出，在不同翻堆温度中，温度60℃枸杞枝条粉发酵中堆体的香浓指数、优势度指数和丰富度指数最高，分别为2.326、0.941和20.33；在不同含水率处理中，含水率下限为60%枸杞枝条粉发酵中堆体的香浓指数、优势度指数和丰富度指数分别为2.321、0.934和20.22，显著高于40%含水率处理；在接种不同微生物菌剂中，以接种粗纤维素降解菌和锯末发酵菌明显增加了高温期枸杞枝条粉发酵中堆体的微生物多样性，香浓指数、优势度指数和丰富度指数分别为2.365、0.930、18.78和2.324、0.927、18.56，显著高于接种堆肥发酵菌剂处理。在添加不同氮源中，以添加油饼和鸡粪明显增加了高温期枸杞枝条粉发酵中堆体的微生物多样性，香浓指数、优势度指数和丰富度指数分别为2.336、0.937、20.00和2.294、0.919、17.56，显著高于添加尿素氮源处理。说明控制好翻堆温度、含水率、接种粗纤维和锯末降解菌剂、添加油饼和鸡粪氮源增加了枸杞枝条粉堆体高温期的微生物多样性，有利于分解堆肥中的有机质，促进木质纤维素降解，促进枸杞枝条粉基质的腐熟。

表4 不同处理枸杞枝条粉基质中微生物群落多样性指数分析Tab.4 Index analysis of microbial community diversity for different wolfberry branches substrates

2.4 各类碳源的利用特征

图2 枸杞枝条粉基质发酵高温期中微生物对6类碳源的利用Fig.2 Utilization of wolfberry substrate microorganism on carbon sources of the six group during high temperature period

不同翻堆温度、含水率、微生物菌剂及氮源类型枸杞枝条基质中微生物对6类碳源的利用情况如图2所示。由图2可看出，高温期不同处理枸杞枝条基质化发酵堆体中微生物对6类碳源利用间存在差异，翻堆温度处理枸杞枝条基质微生物对羧酸、芳香化合物和胺类碳源的利用强弱顺序为70℃、60℃、50℃，对多聚化合物、碳水化合物及氨基酸类碳源的利用强弱顺序为60℃、70℃、50℃，处理间存在显著差异；含水率处理枸杞枝条基质微生物对羧酸碳源的利用强弱顺序为50%、60%、40%，对多聚化合物、氨基酸、碳水化合物及芳香化合物类碳源的利用强弱顺序为60%、50%、40%，处理间存在显著差异，对胺类碳源的利用影响不显著；接种不同微生物菌剂枸杞枝条基质微生物对羧酸碳源的利用强弱顺序为堆肥发酵菌剂、锯末发酵菌、粗纤维素降解菌，对多聚化合物、碳水化合物及氨基酸类碳源的利用强弱顺序为粗纤维素降解菌、锯末发酵菌剂、堆肥发酵菌剂，处理间存在显著差异，芳香化合物类碳源的利用强弱顺序为锯末发酵菌、粗纤维素降解菌、堆肥发酵菌剂，处理间存在显著差异，对胺类碳源的利用影响不显著；氮源类型对堆体中微生物对羧酸类碳源的利用情况差异显著，强弱顺序为：尿素、油饼、鸡粪，对多聚化合物、碳水化合物、氨基酸类碳源的利用也存在明显差异，强弱顺序为：油饼、鸡粪、尿素，对芳香化合物和胺类碳源的利用无显著差异。说明添加尿素氮源处理枸杞枝条基质中微生物对羧酸类、芳香类和胺类碳源相对利用较高，对多聚化合物、碳水化合物和氨基酸类的利用能力减弱，翻堆温度60℃、含水率60%、接种粗纤维降解菌剂和添加油饼氮源处理对多聚化合物、碳水化合物和氨基酸类的利用能力较强。

3 讨论

我国农业生物质资源种类繁多、来源广泛、富含大量木质纤维素，且这类物质具有结构坚硬、分解困难的特性，每年约有70万t农林秸秆固体废物被丢弃。堆肥(基质化)处理是较为普遍且有效地处理有机固体废弃物以及畜禽粪便的方法之一[21]，好氧高温堆肥(基质化)是一种经济、环保的生物学木质纤维素降解方法，木质纤维素的降解速率在一定程度上制约着堆肥的发酵周期。本试验中，发酵结束时，枸杞枝条基质纤维素、半纤维素和木质素质量分数均低于处理前，纤维素降解率在15%以上，半纤维素降解率在19%以上，木质素降解率在10%以上，调节好适宜翻堆温度、含水率、接种微生物菌、氮源有利于枸杞枝条粉木质纤维素的降解，其中以温度为60℃、含水率为60%、添加鸡粪氮源及接种粗纤维素降解菌处理枸杞枝条基质木质纤维素降解率较高。这与徐杰等[22]在以牛粪和水稻秸秆为主要原料共发酵、贺新生等[23]以稻草秸秆为主要原料和BEMAL等[24]接种菌剂处理提高木质纤维素降解率研究结果一致。

堆肥(基质化)的实质是微生物分解和转化有机物的生化代谢过程，其中微生物群落的代谢能力是影响有机物减量化、资源化的关键因素[25-26]，研究微生物群落代谢特征可以揭示堆肥(基质)化过程中的有机物降解机制及优化堆肥(基质化)工艺[27]。平均颜色变化率是表示微生物的平均活性的指标之一，反映了微生物对碳源的利用能力[28]，从功能代谢方面显示了微生物群落结构多样性。本试验中，翻堆温度、含水率、接种微生物菌及添加氮源条件下枸杞枝条基质微生物活性随着培养时间的延长而不断升高，以翻堆温度为60℃、含水率为60%、接种粗纤维降解菌及添加油饼处理微生物群落代谢的平均颜色变化率在整个培养期中均最高，分别为1.019、1.062、0.943和1.117，此处理微生物多样性香浓指数、优势度指数和丰富度指数较高，显著高于其他条件下的相应值，说明控制好翻堆温度、含水率、接种粗纤维降解菌剂、添加油饼氮源有利于增加枸杞枝条基质高温期的微生物的活性和多样性，提高了对部分碳源的代谢能力。这与史龙翔等[29]以猪粪和果树枝条为原料，接种复合菌剂显著提高堆肥中微生物的平均颜色变化率研究结果一致。与FRANCESCO等[30]以家庭动物源的厨房废弃物为原料，添加填充剂堆肥表型微生物多样性提高研究结果相似。

4 结论

(1)从枸杞枝条基质的木质纤维素降解来看，发酵结束时，枸杞枝条基质纤维素、半纤维素和木质素质量分数均低于处理前，纤维素降解率在15%以上，半纤维素降解率在19%以上，木质素降解率在10%以上，适宜翻堆温度、含水率、接种微生物菌、氮源有利于枸杞枝条粉木质纤维素的降解，其中以温度为60℃、含水率为60%、添加鸡粪氮源及接种粗纤维素降解菌处理枸杞枝条基质木质纤维素降解率较高，效果较好。

(2)从枸杞枝条基质发酵高温期的微生物群落结构多样性特征来看，翻堆温度为60℃、含水率为60%、接种粗纤维降解菌及添加油饼处理提高了枸杞枝条基质高温期的微生物的平均颜色变化率，增加了枸杞枝条粉堆体高温期的微生物活性和多样性，提高微生物对部分碳源的代谢能力，如多聚化合物、碳水化合物和氨基酸类等，有利于分解枸杞枝条基质化发酵中的有机质，促进枸杞枝条粉基质木质纤维素降解和腐熟。

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Characteristics of Degradation of Lignocellulose and Microbial Community Diversity during Fermentation of Wolfberry Branches Substrate

FENG Haiping1YANG Dongyan1BAI Shenghu2XIE Hua1LIU Xiaomei2PEI Hongxia1
(1.InstituteofGermplasmResources,NingxiaAcademyofAgricultureandForestryScience,Yinchuan750002,China2.GuyuanYuanzhouDistrictAgriculturalTechnologyPromotionCenter，Guyuan756000,China)

The Chinese wolfberry branch, normally as agricultural wastes, is one of the most important renewable and reuseable resources of plant fibers in Ningxia. To improve the efficiency of wolfberry branch utilization, the characteristics of lignocellulose degradation, microbial community metabolism and diversity were studied during the fermentation of wolfberry branches substrate. By design of orthogonal experiment, wolfberry powder branches and sophora alopecuroides stem powder mixed in ratio of 4∶1 were used to study the influence of fermentative factors on microbial community structure and diversity during the fermentation by Biolog-ECO system. The results showed that at the end of the fermentation, the degradation rates of cellulose, hemicellulose and lignin were stayed above 15%, 19% and 10%, respectively. The treatment, which added oil cake and inoculated with coarse cellulose degrading bacteria, got the higher degradation rates of lignocellulose at temperature of 60℃, moisture content of 60%, and the degradation rates of cellulose, hemicellulose and lignin were 18.12%～19.22%, 23.55%～25.21% and 13.87%～14.24%, respectively, which were increased significantly than those of the other treatments; microbial activity and diversity during high temperature period were increased. Average well color development of microbes were 1.019, 1.062, 0.943 and 1.117, and Shannon-Wiener index, Simpson index and richness index of microbes were 2.321～2.365, 0.930～0.941 and 18.78～20.33, respectively. The ability to metabolize microorganism on part of carbon source was improved, which resulted in promoting degradation of organic matter.

wolfberry branches powder； lignocellulose; degradation； microbes； community diversity； average well color development

2017-03-13

2017-03-31

国家自然科学基金项目(31501803)和宁夏农林科学院科技创新先导资金项目(NKYQ-16-05)

冯海萍(1981—)，女，助理研究员，主要从事蔬菜生理及无土栽培研究，E-mail: fenghaiping2005@163.com

谢华(1965—)，男，研究员，主要从事蔬菜学研究，E-mail: xiehua0002@163.com

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.05.039

TQ353.4+2; S317

A

1000-1298(2017)05-0313-07