金属有机骨架化合物PCN 222对酶抑制法的增敏研究

徐霞红 郭玉娜 王新全 王祥云 齐沛沛 汪志威

(浙江省农业科学院农产品质量标准研究所， 杭州 310021)

金属有机骨架化合物PCN 222对酶抑制法的增敏研究

徐霞红 郭玉娜 王新全 王祥云 齐沛沛 汪志威

(浙江省农业科学院农产品质量标准研究所， 杭州 310021)

合成了一种命名为多孔配位网络结构222 (PCN 222)的金属有机骨架化合物(MOFs)，并将其用作农药残留检测中酶抑制法的新型增敏剂。对所制备的PCN 222微观形态、结构、X射线衍射(XRD)和热稳定性进行了系统表征。证明该MOFs是一种多孔的棒状结构(棒状结构主轴为六面体)，并具有大的表面积和强的热稳定性。基于PCN 222的性能，在有机磷农药快检中添加PCN 222材料，增强了传统酶抑制法的灵敏性。为进一步研究，将毒死蜱选为模型分析物，在最佳条件下，吸光度变化量提高了68.8%(3 min内)。此外，该方法具有简单、快速、成本低的优点，为复杂样品基质中有机磷农药的测定提供了一种实用工具。

金属有机骨架化合物； 多孔配位网络结构222； 毒死蜱； 酶抑制法； 增敏

引言

农药长期大量使用甚至滥用对空气、水源、土壤和农牧产品造成了严重污染，破坏了生态环境，人类健康也因此受到影响[1-2]。自20世纪80年代以来，有机磷农药由于其见效快、效果好且使用方便逐步成为世界上使用最多的农药[3]。据世界卫生组织统计，全世界每年有机磷农药中毒者约300万人，其中多达220 000人死亡[4]。因此，对蔬菜、水果中的有机磷农药进行快速测定成为亟待解决的问题。

目前蔬菜和水果产品中农药残留的检测方法包括气相色谱法、液相色谱法及液相色谱-质谱联用等，这些大型精密仪器检测结果准确、可靠，但仪器价格昂贵、检测成本高，检测费时，不能实现现场检测，无法在基层单位推广使用[5-7]。酶抑制法是研究最多且相对成熟的一种对部分农药残留进行快速检测的技术，我国已将其列入国家标准[8-9]。该法由于其具有快速、简便、成本低及易于现场检测等优点，已经成为国内外快速检测农药残留的主流技术[10]。然而，传统酶抑制法却存在很大的局限性，如灵敏度常不能满足实际应用的需要[11]。

金属有机骨架化合物(Metal-organic frameworks，MOFs)是由金属离子与有机配体通过自组装过程杂化生成的一类具有周期性多维网状结构的多孔晶体材料，具有纳米级的骨架和规整的孔道结构，大的比表面积和孔隙率以及小的固体密度[12-14]。在吸附、分离、催化等方面均表现出了优异的性能，已成为新材料领域的研究热点[15-17]。MOFs材料的改性研究在真菌毒素[18]、细胞[19]、生物大分子[20]的分析领域已广受关注。而将MOFs材料与酶抑制法结合起来，充分利用MOFs材料的吸附和催化性质实现更高效的酶抑制法检测，却未见报道。

为将MOFs材料与酶抑制法结合起来，探究更灵敏的农药速测技术，本文使用H2-TCPP(TCPP =5,10,15,20-四(4-羧基苯基)卟啉)作为MOFs配体，并选择高度稳定的Zr6簇作为节点组装稳定Zr-MOFs，命名为多孔配位网络结构222 (PCN 222，也称MOF-545或MMPF-6)，并研究该材料在酶抑制法增敏上的效果。

1 原理

1.1 理论基础

有机磷和氨基甲酸酯类农药对动物体内乙酰胆碱酯酶(AChE)具有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正比。正常情况下的反应如图1所示，酶催化神经传导代谢产物(硫代乙酰胆碱)水解，其水解产物与显色剂二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反应，产生黄色物质(TNB-C5H13N)，用分光光度计在412 nm处测定吸光度随时间的变化量，可计算出抑制率，通过抑制率可以判断出样中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。

图1 酶抑制法反应的原理Fig.1 Reaction principle of AChE-inhibited method

1.2 实验原理

本实验的改良如图2所示。在一定条件下，在乙酰胆碱酯酶及其底物(乙酰胆碱)的共存体系中加入农产品样品提取液，如果样品中不含有机磷或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就不被抑制，乙酰胆碱就会被酶水解，水解产物与加入的显色剂反应就会产生颜色。3 min内的吸光度(A)变化量为ΔA。金属-有机框架材料 PCN 222 具有高孔隙率和比表面积[12,21]，能有效富集 AChE 及农药分子，且该MOFs配体H2-TCPP具有优良的催化活性，在一定空间内增强反应物浓度并提高显色反应速率，3 min内的吸光度(A′)变化量为ΔA′，在PCN 222作用下显色速率将大大提高，ΔA′>ΔA，从而改善酶抑制法的灵敏度[22]；反之，如果试样提取液中含有一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就被抑制，试样中加入的底物就不能被酶水解，从而不显色。

图2 酶抑制法增敏示意图Fig.2 Schematic illustration of sensitized ache inhibition method

1.3 抑制率计算方法

抑制率I的计算公式为

式中 ΔA0——空白样品3 min内412 nm处吸光度变化量

ΔAt——待测样品(含农药)3 min内412 nm处吸光度变化量

2 试验

2.1 仪器及试剂

S/M 100型高压反应釜(北京世纪森朗实验室仪器有限公司)；SU8010型场发射扫描电子显微镜(日立高新技术公司)；Q500 TGA型热重分析仪(美国TA仪器公司)；Primo R型低温冷冻离心机(美国热电公司)；SpectraMax M5型多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)；96型微孔板(德国Greiner Bio-One有限公司)；Mini型金属浴装置(杭州奥盛仪器有限公司)；SCILOGEX MX-S型旋涡混合器(美国赛洛捷克公司)。

5,10,15,20-四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)、氯化锆(ZrCl4)、苯甲酸、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)、硫代乙酰胆碱(ATCh)和乙酰胆碱酯酶(AChE)均为分析纯，都购自美国Sigma公司。

2.2 PCN 222的合成

取ZrCl4140 mg、TCPP 100 mg及苯甲酸5 400 mg于烧杯中，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)16 mL，超声处理使其均匀；将混合均匀的溶液倒入反应釜，120℃反应48 h；水热反应完成后将产物离心去除上层液体，乙醇反复离心洗涤3次；100℃干燥10 h即可得到PCN 222固体粉末。

2.3 分析步骤

实验选取有机磷农药毒死蜱为研究对象。其中空白加入0.5 mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH 值 7.4)，再依次加入10 μL的PCN 222乙醇分散液(10 μg/mL)，5 μL的AChE(1 U/μL)，20 μL的DTNB(8 μg/L)，摇匀后于37℃放置15 min(控制每批样品放置时间一致)。提前设置好紫外分光光度计各项检测参数，取100 μL混合液于96型微孔板中，迅速加入2 μL ATCh(8.3 μg/L)，记录反应3 min内的412 nm吸光度随时间的变化。对照溶液除加入一定量的毒死蜱外保证其他操作与空白一致。

2.4 实际样品检测

青菜叶搅拌成泥，称取1 g，加入2 mL PBS分散，离心分离取上清液于低温(4℃)保存备用。分别取青菜基质和PBS溶液，均添加10 μg/mL的毒死蜱，其余实验条件保持一致(如2.3节)。用MOFs 材料改良 AChE 的酶促反应，测定酶反应体系的动力学数据。

3 结果与讨论

3.1 PCN 222的表征

3.1.1 SEM表征

为研究PCN 222晶体生长的微观形貌，也为了表征MOFs材料是否成功制备，对所制备的PCN 222进行扫描电子显微镜(SEM)(图3)的表征。从图3a可以看出，制备的PCN 222晶体材料为六面棱柱结构，从棒状结构不规则断裂的横截面(图3b)可清楚地观察到，棒状形貌由层叠分布的片状多晶形成，并吸附有其他小颗粒晶型碎片。这一表征同时证明，晶型PCN 222 MOFs材料已成功制备。

图3 PCN 222的SEM表征Fig.3 SEM images of PCN 222

3.1.2 热重表征

为研究PCN 222的热稳定性，对PCN 222进行热重分析(TGA)，在氮气气氛下以10℃/min升温速率由0℃升温至600℃。其实验结果如图4a所示，该PCN 222材料具有非常好的热稳定性，升温至450℃基本无明显失重(质量分数85%以上)，即使升温至600℃，仍保持有65%左右的质量。

图4 PCN 222的TGA与XRD表征Fig.4 TGA and XRD patterns obtained for PCN 222

3.1.3 X单晶衍射(XRD)表征

为研究PCN 222的结晶情况，对PCN 222进行XRD表征，其结果如图4b所示，图中2θ表示X射线衍射角度。可以看出XRD谱图峰型较好，峰值为5.86°、7.86°、8.30°和10.63°,证明了结晶晶体主轴为六面体[19]，这与SEM表征结果高度一致。同时该表征也进一步证明了晶型材料PCN 222已成功合成。

3.2 PCN 222的用量与优化

3.2.1 PCN 222的使用对酶反应的影响

选取毒死蜱为典型的有机磷农药，分析PCN 222对酶抑制法的影响。固定检测波长及其他条件，按照2.3节实验方法配制2份溶液，其中1份含PCN 222，另1份中不含PCN 222，然后在412 nm波长下，测定2份溶液吸光度随时间的变化。结果如图5a所示，实验表明PCN 222的加入使显色体系在3 min内的吸光度变化量增大，较未使用PCN 222系统的吸光度变化量增敏68.8%。同时，还测定了3 min时的波谱图。其结果如图5b所示，可以看出，加入PCN 222较未使用PCN 222的显色体系在反应至3 min时，只有吸光度(412 nm处)明显增大且无其他区别。

图5 PCN 222对酶抑制法的影响Fig.5 Effect of PCN 222 on ache inhibition method

3.2.2 PCN 222用量的优化

为了实现最佳的增敏效果，对PCN 222的用量进行优化。选取质量浓度为1、5、10、50、100 μg/mL的PCN 222进行实验。其结果表明，质量浓度低于10 μg/mL时，抑制率随PCN 222用量的增加而增大，这可归因于局部的富集与催化作用随PCN 222用量的增加而增大；质量浓度大于10 μg/mL时，抑制率随PCN 222用量的增加而降低，这可能是浓度高时，PCN 222某些特性影响了显色反应的进行。为进一步研究其原因，对不同质量浓度PCN 222对酶反应的影响进行研究(均未添加农药)，结果如表1所示，可以看出，PCN 222质量浓度为1～10 μg/mL时，3 min内的吸光度变化量随PCN 222用量的增多逐步增大；而PCN 222质量浓度为10～50 μg/mL时，在3 min内的吸光度变化量随PCN 222用量的增多虽也在增大但其幅度大大降低；PCN 222质量浓度为50～100 μg/mL时，在3 min内的吸光度变化量随PCN 222用量的增多反而降低，其原因很可能是较高质量浓度的PCN 222对酶活产生了抑制。为确保最佳实验效果，选取10 μg/mL作为最佳质量浓度。

表1 不同浓度的PCN 222对酶反应的影响Tab.1 Effect of concentrations of PCN 222 on enzyme reaction

3.3 PCN 222对不同浓度毒死蜱的增敏效果

为进一步分析PCN 222对酶抑制法的增敏作用，配置了系列质量浓度的毒死蜱标准溶液，包括0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10 μg/mL。将此系列质量浓度标液按照2.3节的方法同时进行2组测定。其中1组加入PCN 222而另1组不加，保持其他条件一致，测定3 min内412 nm波长处吸光度随时间的变化，并分别计算2组溶液每个浓度对应的抑制率，其结果如图6及表2、3所示。实验表明PCN 222在0.01～10 μg/mL质量浓度范围内均明显提高了抑制率，改善了传统酶抑制法的灵敏度。也可看出，未加入PCN 222时空白对照3 min内吸光度变化量ΔA0为0.901 7，加入PCN 222时空白对照3 min内吸光度变化量ΔA′0为1.15，ΔA′0>ΔA0，进一步验证了实验的原理。

图6 PCN 222对毒死蜱的增敏效果Fig.6 Effect of PCN 222 on sensitization of chlorpyrifos

表2 无PCN 222增敏时的酶抑制情况Tab.2 Situation of ache inhibition without PCN 222

表3 PCN 222增敏时的酶抑制情况Tab.3 Situation of ache inhibition method with PCN 222

3.4 实际样品分析

为验证PCN 222增敏的酶抑制法是否可应用于实际样品检测，以青菜基质为例进行研究。将添加有10 μg/mL毒死蜱的青菜基质与10 μg/mL的毒死蜱标液同时按照2.3节的方法进行实验，测定3 min内412 nm波长处吸光度随时间的变化，其变化量及抑制率如表4所示，可以看出，以实际样品作为反应介质与PBS的抑制情况相差无几，且实际样品对本研究干扰很小，同时说明该研究可用于实际样品的检测。

表4 实际样品的酶抑制情况Tab.4 Situation of ache inhibition method in real sample

4 结束语

制备了一种比表面积高、热稳定强的MOF材料(PCN 222)，并将其成功应用于酶抑制法的增敏。对所制备的PCN 222的微观形态、结构、XRD和热稳定性进行了系统的表征。证明该MOFs是一种多孔的棒状结构(棒状结构主轴为六面体)，具有大的表面积和强的热稳定性。PCN 222可有效富集 AChE 及农药分子，在一定空间内增强反应物浓度并提高抑制效率，增敏幅度高达68.8%，从而大大改善酶抑制法的灵敏度。与此同时，蔬菜基质也不会对酶反应造成干扰，因此该方法推广到实际应用中也有很高的潜力。

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Porous Metal-organic Frameworks: PCN 222 Sensitization to Ache Inhibition Method

XU Xiahong GUO Yu’na WANG Xinquan WANG Xiangyun QI Peipei WANG Zhiwei
(InstituteofQualityandStandardforAgro-products,ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou310021,China)

Food safety issues caused by pesticide residues become the spotlight of public concerns all over the world. Metal-organic frameworks: porous coordination network 222 (MOFs:PCN 222) were synthesized and investigated as a novel sensitizer for AChE-inhibited method. TCPP (Tetrakis (4-carboxyphenyl)porphyrin) was employed as a ligand and highly stable Zr6clusters were chosen as nodes for the assembly of stable Zr-MOFs. With carefully selected starting materials, a 3D porous MOFs was successfully constructed. Some properties of the prepared PCN 222, including structure, morphology X-ray diffraction (XRD) and thermostability were studied systematically. Porous virgate structure (spindle hexahedron), large surface area and strong thermostability were obtained for the MOFs. Based on the PCN 222, a sensitive AChE-inhibited method was developed. As a proof of concept, chlorpyrifos was used as a model analyte. Under the optimal conditions, absorbance increasing efficiency was increased by 68.8% (in 3 min), which substantially improved the sensitivity of the colorimetric method compared with traditional ache inhibition method. The results revealed that the sensitization range obtained for chlorpyrifosis was approximately 0.01～10 μg/mL. Furthermore, the biosensor was successfully applied to the quantitative assay of chlorpyrifos in synthetic sample (vegetable matrix). In addition, the method possessed the advantages of simplicity, rapidity and cost-effective. Hence, the developed sensitized AChE-inhibited method might provide a useful and practical tool for organophosphorus pesticide determination and related food safety analysis.

metal-organic frameworks; porous coordination network 222; chlorpyrifos; AChE-inhibited method; sensitization

2017-03-26

2017-04-10

国家自然科学基金项目(31671940)

徐霞红(1983—)，女，副研究员，主要从事农产品质量安全研究，E-mail: xiahongxu126@126.com

王新全(1979—)，男，副研究员，主要从事农药残留检测技术研究，E-mail: wangxinquan212@163.com

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.05.024

S481+.8； X502

A

1000-1298(2017)05-0193-06