姬松茸菌株J1与J77镉富集差异及生理响应机制

刘朋虎，李波，江枝和，王义祥，翁伯琦*

（1.福建农林大学国家菌草工程技术研究中心，福州 350002；2.福建农林大学资源与环境学院，福州 350002；3.福建省农业科学院土壤肥料研究所，福州 350013；4.福建省农业科学院农业生态研究所，福州 350013）

姬松茸菌株J1与J77镉富集差异及生理响应机制

刘朋虎1，李波2，江枝和3，王义祥4，翁伯琦4*

（1.福建农林大学国家菌草工程技术研究中心，福州 350002；2.福建农林大学资源与环境学院，福州 350002；3.福建省农业科学院土壤肥料研究所，福州 350013；4.福建省农业科学院农业生态研究所，福州 350013）

以姬松茸菌株J1及其诱变菌株J77为材料，研究不同浓度镉对J1、J77菌丝生长与产量、镉富集量及相关氨基酸含量等的影响，分析J1、J77对镉吸收与耐受性差异及生理响应机制。结果表明：随着外源添加镉浓度的增加，J1、J77菌丝生长速度、产量均先增加后降低，低浓度镉能促进姬松茸生长、提高产量；相同浓度外源镉胁迫下，J77菌丝及子实体中镉含量均低于J1，且差异显著（P＜0.01），J77为低富集镉的菌株；菌丝中镉含量与子实体中镉含量显著正相关（R2＞0.97）；J1、J77子实体中半胱氨酸含量均先降低后增加，低浓度镉胁迫下J1半胱氨酸含量较高，高浓度镉胁迫下J77中半胱氨酸含量较高，半胱氨酸可能与姬松茸镉富集密切相关。

姬松茸；镉；富集；重金属

姬松茸（Agaricus brasiliensis）又名巴西蘑菇、柏氏蘑菇、小松菇等，原产于巴西、秘鲁和美国等地，是一种珍贵的食药用菌。1992年，福建省农业科学院从日本引进姬松茸并栽培成功[1]。经过30多年的发展，我国已经成为世界上姬松茸主要产地之一[2]。姬松茸具有杏仁的香味，高蛋白、低脂肪，富含纤维素和矿物质元素，是一种营养价值丰富的食品[3]。且随着研究的深入，研究人员发现姬松茸菌丝和子实体中含有多糖、核酸、类固醇、凝集素等多种活性成分，具有抗肿瘤、免疫调节、抗突变、抗炎和抗氧化等多种药用功能[4-5]。

姬松茸产业发展潜力巨大，但是其菌丝对镉有很强的富集能力，造成子实体中镉极易超标，危害食品安全及出口创汇。镉是毒性很强的重金属元素之一，可以蓄积于人的肾、肝等器官中，严重危害人类健康。据报道，姬松茸子实体中镉含量远远高于培养料镉含量，也远远高于其他重金属[6-7]。子实体中镉含量超标已成为影响姬松茸产业健康发展的一个重要因素。研究表明，不同的姬松茸菌株对镉富集能力差异显著[8-11]。所以筛选或者选育低富集镉的姬松茸菌株是解决姬松茸镉超标的有效方法之一。

本课题组前期以福建省农业科学院从日本引进的菌株J1（福建省主栽品种之一）为出发菌株，利用辐射诱变技术选育到一株高产姬松茸新菌株J77，其子实体中镉含量显著降低[12]。本研究以添加外源镉的形式研究了不同浓度镉胁迫对J1、J77菌丝生长、产量的影响，J1、J77对镉的富集规律及差异。另据报道，真菌中半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸与镉的解毒密切相关[13]，因此本研究还测定了不同浓度镉胁迫下J1、J77子实体中与镉富集密切相关的这3种氨基酸含量的变化规律。本研究为进一步深入研究菌株J77低镉富集机制奠定基础，同时也为低富集镉姬松茸菌株选育提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

本研究供试菌株为姬松茸菌株J1与J77，均保藏于福建农林大学国家菌草工程技术研究中心。

1.2 试验设计

本试验分2个部分：（1）不同浓度镉对J1、J77菌丝生长的影响。在PDA优化固体培养基及液体培养基中加入一定浓度梯度的外源镉，使添加外源镉的浓度分别为0、0.5、1、1.5、2、2.5、5、10、15、20、25、50mg·L-1，分别测定2个菌株在不同浓度镉胁迫下菌丝生长速度、菌丝鲜量、菌丝中镉含量，分析2个菌株对镉富集及耐受性差异；（2）不同浓度镉对J1、J77子实体生长发育的影响。在培养料中加入一定浓度梯度的外源镉，使添加外源镉的浓度分别为0、0.5、1、1.5、2、2.5、5、10、15、20、25、50mg·kg-1，分别测定2个菌株在不同浓度镉胁迫下的产量、子实体中镉含量及与镉富集密切相关的半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸含量，分析2个菌株之间的差异。

1.3 不同浓度镉对J1、J77菌丝生长的影响

1.3.1 对菌丝生长速度的影响

PDA优化培养基：马铃薯230 g，蔗糖20 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁0.5 g，维生素B110mg，琼脂粉20 g，蒸馏水1 L，pH自然。

镉母液配制：称取2.031 4 g CdCl2·2.5H2O，溶于蒸馏水并定容于1 L容量瓶中，母液镉浓度为1 g·L-1。

将镉母液替换部分PDA优化培养基中的水，配制成含有不同浓度镉的培养基（浓度见1.2），灭菌后无菌条件下倒于培养皿上。先将菌种接种于培养皿上，28℃培养，待菌落直径4～6 cm时，在同一直径的圆圈上用打孔器打出相同的菌丝块，接种于含有镉的培养皿上，28℃培养，采用平板划线法测定菌丝的生长速度[14]，每个处理4个平行。

二甲戊灵与扑草净混用防除绿豆田杂草的效果及对绿豆的安全性……… 程玉臣，赵存虎，贺小勇，孔庆全，张富荣，张 辉（80）

1.3.2 对菌丝鲜重影响

与平板处理相同，将不含琼脂PDA优化培养基与镉母液配制成不同镉浓度培养基，分装于三角瓶中，高压灭菌后接种，于28℃静置培养30 d，过滤称取菌丝鲜重，并测定菌丝中镉含量。

1.4 不同浓度镉对J1、J77子实体发育的影响

培养料配方：棉籽壳20%，玉米芯12.5%，牛粪35%，麸皮10%，稻草20%，CaCO31%，石灰1.5%。

栽培方法：采用熟料袋栽方式出菇。将配方中各种培养料混合均匀，按1∶1.25的比例计算加水量，先按试验设计将不同镉母液加入到水中，再将水与培养料混合均匀；混合均匀的培养料分装到聚丙烯袋中，每袋装料0.8 kg，放入高压灭菌锅中，121℃灭菌2 h，接种后在26℃恒温培养室中培养，待菌丝走满袋后，移到栽培室，开袋覆土。每个菌株每个处理设20个重复。覆土后15 d左右即有菇蕾出现，出菇后统计不同浓度镉胁迫下2个菌株的产量，同时测定不同处理子实体中镉含量及半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸含量，计算镉的富集系数。

1.5 测定方法

镉含量采用火焰原子吸收法进行测定[15]，氨基酸含量采用《食品中氨基酸测定》（GB/T 5009.124—2003）方法进行[16]。

1.6 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 不同浓度镉对J1、J77菌丝生长的影响及菌丝对镉的富集规律

随着外源添加镉浓度的增加，J1和J77菌丝生长速度均呈现先增加后减少的规律，与之对应的菌丝鲜重也呈现先增加后减少的趋势（图1）。菌株J1在添加外源镉浓度为1.5mg·L-1时菌丝生长速度最快，而J77在添加外源镉浓度为2mg·L-1时菌丝生长速度最快；J1在添加外源镉1mg·L-1时菌丝鲜重最大，J77在添加外源镉2mg·L-1时菌丝鲜重最大。从菌丝中镉含量及镉富集系数来看（表1）：随外源镉浓度的增加，J1、J77菌丝中镉含量均增加；J1菌丝对镉富集系数在180～310之间，在外源镉为2mg·L-1时，富集系数最高；J77菌丝对镉富集系数在113～193之间，在外源镉为25 mg·L-1时，富集系数最高；相同外源镉浓度下J1菌丝中镉含量高于J77。

图1 镉对J1、J77菌丝生长的影响Figure 1 EffectofCd in differentconcentration onmycelium growth rate of J1and J77

2.2 不同浓度镉胁迫下J1、J77产量及子实体中镉含量

在培养料中添加一定浓度梯度的镉，出菇后收集子实体，测定不同浓度镉对J1、J77产量的影响及子实体中镉的含量。产量统计结果表明（图2）：随着外源镉浓度的增加，J1和J77产量均先增加后减少；且2个菌株均在1mg·kg-1时产量最高。子实体中镉含量检测表明（表2）：随镉浓度的增加，J1、J77中镉含量逐渐增加，对镉富集系数逐渐减少；J1对镉的富集系数为24～58，J77对镉富集系数为19～45；在相同浓度下，J1子实体中镉的浓度均高于J77，且差异达到显著或极显著水平，J77对镉富集显著降低。

表1 不同浓度镉胁迫下J1、J77菌丝中镉含量及富集系数Table 1 Effectof Cd in different concentration on Cd content and enrichmentcoefficientof J1and J77mycelium

图2 镉对J1、J77产量的影响Figure2 EffectofCd in differentconcentration on yields of J1and J77

对J1、J77菌丝和子实体中镉含量相关性进行分析，结果表明：J1菌丝与子实体中镉含量相关系数为0.996，差异极显著；J77菌丝与子实体中镉含量相关系数为0.971，差异极显著。此结果表明菌丝中镉含量与子实体中镉含量显著正相关，菌丝对镉的吸收能力影响子实体中的镉含量。

2.3 不同浓度镉胁迫对J1、J77中与镉富集相关的氨基酸含量的影响

本研究测定了不同浓度镉胁迫下J1、J77子实体中半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸含量的变化。半胱氨酸检测结果表明（图3）：随着外源镉浓度的增加，菌株J1和J77半胱氨酸的含量均表现为先减少后增加的规律；J1中半胱氨酸含量变化幅度较小，J77中半胱氨酸含量变化幅度较大，当外源镉浓度在25mg·kg-1以上时J77中半胱氨酸含量急剧上升；在2mg·kg-1以下J1中半胱氨酸含量大于J77中的含量，且差异极显著；在15mg·kg-1以上时，J77中半胱氨酸含量大于J1中的含量，且差异极显著。

表2 不同浓度镉胁迫下J1、J77子实体中镉含量及富集系数Table 2 EffectofCd in differentconcentration on Cd contentand enrichmentcoefficientof J1and J77fruiting bodies

甘氨酸检测结果表明（图4）：不同外源镉处理下，J1、J77子实体甘氨酸含量变化较小；添加外源镉浓度在0.5～2.5mg·kg-1之间时，J1中甘氨酸含量大于J77中含量，而在5～50mg·kg-1之间，J1、J77子实体中甘氨酸含量无明显规律。

谷氨酸检测结果表明（图5）：在相同浓度外源镉胁迫下，J1、J77子实体谷氨酸含量变化较小；0.5～2.5 mg·kg-1之间，J1中谷氨酸含量大于J77中含量，而在5～50mg·kg-1之间，J1、J77子实体中甘氨酸含量无明显规律。进一步分析J1、J77子实体中甘氨酸与谷氨酸含量，发现二者变化规律一致。

图3 镉对J1、J77子实体半胱氨酸含量的影响Figure3 EffectofCd in differentconcentration on Cyscontentsof J1and J77fruiting bodies

图4 镉对J1、J77子实体甘氨酸含量的影响Figure 4 EffectofCd in differentconcentration on Gly contentsof J1and J77fruiting bodies

图5 镉对J1、J77子实体谷氨酸含量的影响Figure 5 EffectofCd in differentconcentration on Glu contentsof J1and J77fruiting bodies

3 讨论

姬松茸菌丝对镉有很强的富集能力，已经引起越来越多学者的关注，但是其机理还不甚清楚[17]。本课题组前期以菌株J1为出发菌株，经过60Co-γ射线诱变，获得一株低富集镉的新菌株J77。本研究在此基础上，采用添加外源镉的方法，进一步研究了J1、J77对镉吸收与耐受性的差异，并对两个菌株中与镉富集密切相关的氨基酸含量进行检测，初步揭示了J77低富集镉的生理机制，为进一步深入研究分子机理奠定了基础。

随着镉浓度增加，J1和J77菌丝生长速度均表现为先增加后减少的趋势，表明低浓度的镉能够促进姬松茸菌丝生长，这与以前报道一致[18]。在添加不同浓度外源镉处理下，J77菌丝体与子实体中镉含量均低于J1，表明J77菌丝对镉吸收较少，导致菌丝及子实体中镉含量较低，J77为低富集镉的菌株。从菌丝与子实体镉含量相关性分析结果来看，J1和J77菌丝与子实体中镉含量相关性均为极显著（97%以上），说明采用添加外源镉的形式液体培养菌丝可以作为初步筛选低镉姬松茸菌株的方法。

真菌中普遍存在对金属离子具有亲和能力的蛋白质（肽），称为金属硫蛋白（MT），可以结合进入细胞内的重金属离子，使其以不具有生物活性的无毒的螯合物形式存在，降低金属离子的活性，从而减轻金属离子对细胞的毒害作用。相关研究表明，在食用菌中的金属硫蛋白通常由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸等3种氨基酸组成[19]。李开本等[6]研究表明，巴西蘑菇子实体中谷氨酸、胱氨酸及甘氨酸等构成富镉多肽的三种主要氨基酸含量均明显高于双孢蘑菇。江启沛[19]分析姬松茸富镉的原因之一是细胞内特异的与Cd2+结合的谷氨酸含量高，并发现Cd2+结合蛋白的存在。江枝和等[20]用灰色系统理论分析了姬松茸子实体中17种氨基酸含量与重金属镉含量的关系，结果表明：半胱氨酸含量与镉含量的关联系数最大，谷氨酸含量与金属镉含量两者关联系数最小[20]。本研究结果表明，随着镉浓度增加，两个菌株中半胱氨酸含量呈明显规律性，且高浓度镉胁迫下，J77中半胱氨酸显著增加，表明半胱氨酸可能对姬松茸解毒具有重要作用。

4 结论

J1、J77菌株对镉富集具有明显差异性，J77为低富集镉的菌株；菌丝中镉含量与子实体中镉含量显著正相关，采用菌丝液体培养的方法可以初步筛选低镉菌株；半胱氨酸的含量可能与姬松茸镉富集有关。

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Com parison and physiologicalm echanism sof cadm ium（Cd）accumulation by strain J1and mutant J77of Agaricusbrasiliensis

LIUPeng-hu1,LIBo2,JIANGZhi-he3,WANGYi-xiang4,WENGBo-qi4*
（1.National Engineering Research Centerof JUNCAO Technology,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China;2.College ofResources and Environment,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China;3.Institute of Soiland Fertilizer Sciences,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013,China;4.Institute of Agricultural Ecology,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013,China）

Agaricus brasiliensis is an edible andmedicinalmushroom with a strong capability of cadmium accumulation,whichmay impact food security.Using a combination of60Co-γray and UV light,we previously bred a new A.brasiliensis strain named J77by irradiating mycelium of strain J1.Owing to its low Cd contentand high stable yield,J77wasapproved asa new variety named Fuji77 by the Crop Variety Approval Committee of Fujian Province in 2013.Using the A.brasiliensis strain J1and itsmutant J77as researchmaterials,the effects of Cd in differentconcentrationsonmycelium growth rate and yields,Cd accumulation and contentsof three amino acids inmycelium,and fruiting bodies of J1and J77were analyzed by adding different concentrations of Cd into the culturemedium to reveal the differences in Cd uptake, tolerance,and physiological responsemechanisms between J1and J77.The results showed thatmycelium growth rate and yields of J1and J77increased firstand then declined with the increase of Cd concentration,which indicated that Cd of lower concentrations could promote the growth ofmycelium and increase the yields.Under the same concentration of Cd,Cd contents in bothmycelium and fruiting body of J77were significantly lower than those of J1,which indicated that J77was a lower Cd accumulative strain.In addition,there was a significant positivecorrelation between Cd contents inmycelium and fruiting bodies（R2＞0.97）.Cysteine（Cys）contents in both fruiting bodies of J1and J77decreased firstand then increased with the increase of Cd concentrations.Cys contentwas significantly higher in fruiting body of J1compared with J77under lower Cd concentrations.In contrast,the Cys content in the fruitbody of J77was significantly higher than thatof J1under higher Cd concentrations.These results indicated thatCysmightplay an important role in Cd accumulation in A.brasiliensis.

Agaricusbrasiliensis;cadmium（Cd）;accumulation;heavymetal

X171.5

A

1672-2043（2017）05-0863-06

10.11654/jaes.2017-0073

2017-01-13

刘朋虎（1982—），男，山东莘县人，副研究员，主要从事食用菌重金属污染与遗传、育种等方面的研究。E-mail：phliu1982@163.com

*通信作者：翁伯琦E-mail：wengboqi@163.com

福建省自然科学基金项目（2015J01077）；福建省中青年教师教育科研项目（JA13108）；福建省菌草生态产业协同创新中心攻关项目（K80DN8002-JCXTGG16）

Project supported：The Natural Science Foundation of Fujian Province（2015J01077）；Foundation for Young and Middle-aged Teacher of Fujian Education Department（JA13108）；Key SubjectofCooperation Innovation Centerof JUNCAOEcological IndustryofFujian Province（K80DN8002-JCXTGG16）

刘朋虎，李波，江枝和，等.姬松茸菌株J1与J77镉富集差异及生理响应机制[J].农业环境科学学报,2017,36（5）：863-868.

LIUPeng-hu,LIBo,JIANG Zhi-he,etal.Comparison and physiologicalmechanismsofcadmium（Cd）accumulation by strain J1and mutant J77of Agaricus brasiliensis[J].JournalofAgro-EnvironmentScience,2017,36（5）:863-868.