原位胚拯救技术获得花生属区组间杂种的研究

祁 雪，王传堂，王秀贞，吴 琪，孙全喜，王志伟，邵俊飞，唐月异*，关淑艳*

(1. 吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118； 2. 山东省花生研究所，山东 青岛 266100；3. 威海市文登区土壤肥料工作站，山东 文登 264200)



原位胚拯救技术获得花生属区组间杂种的研究

祁 雪1，王传堂2，王秀贞2，吴 琪2，孙全喜2，王志伟2，邵俊飞3，唐月异2*，关淑艳1*

(1. 吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118； 2. 山东省花生研究所，山东 青岛 266100；3. 威海市文登区土壤肥料工作站，山东 文登 264200)

花生野生种尤其是不亲和野生种，具有高产、抗逆等优异基因，但长期以来得不到有效利用。为选育高油酸抗逆花生新品种，以高油酸品种花育963为母本、不亲和野生花生作父本杂交，采用原位胚拯救技术直接收获花生不亲和种间杂种F1。利用MITE转座子分子标记对杂种进行真实性鉴定。结果表明，其中有35粒样品同时具有双亲条带，为真杂种，真杂种率为44.3%。近红外分析表明，真杂种油酸含量显著低于高油酸花生，为杂种真实性提供了旁证。

花生；杂种鉴定；转座子；分子标记；AhMITE1

花生(ArachishypogaeaL.)是世界上重要的经济与油料作物，也是优质植物蛋白的重要来源[1]。近年来，随着经济的发展和人民生活水平的日益提高，对花生品种的品质和抗性等提出了更高要求，因此花生的遗传育种受到高度重视。

花生区组外的野生种，被称为不亲和野生种，野生种具有栽培种不具备的高产因子以及抗逆(耐旱、耐冷、耐热、抗叶部病害)[2]等优异基因。但不亲和野生种与栽培种的杂交存在不亲和障碍，其表现为受精延迟、受精率低、果针生长受阻、即使果针能够入土由于胚在早期败育最终也只能形成有败育种子遗迹的空果。因此，要获得杂交种，必须借助其他手段。目前，国际半干旱所利用体外胚培养技术，获得栽培种与A.glabrata区组间杂种[3-4]。经鉴定，发现杂种继承了野生种的很多抗性基因[4]。此外，栽培种与Procumbentae、Heteranthae、Erectoides等区组间野生种的杂交也已经成功[5]。山东省花生研究所在以往培养栽培种自交果针的经验基础上[6]，授粉后立即用激素处理栽培种四粒红×A.glabrataBenth. PI 262801授粉花基部，取果针离体培养，成功获得了发育良好的种子[7-9]。根据形态和同工酶等特征确定其为真杂种[10]。

微型反向重复转座子(MITE)是由Bureau和Wessler首次在玉米中发现并命名的[11]。在随后的研究中发现MITE广泛分布于其他真核生物基因组中。MITE的结构与非自主原件结构相似，具有TIR和TSD的结构。但它的拷贝性和序列一致性又使其区别于非自主原件，故称其为新的DNA转座子。目前MITE分子标记已应用于水稻[12]、烟草[13]等植物。在花生方面，Shirasawa等[14]根据AhMITE的特征，利用其两端序列开发504对引物，用于杂种鉴定。王洁等[15]对这504对引物进行筛选，其中193对引物扩增效果良好，145对表现出多态性，多态性比率75.13%。王辉等[16]利用转座子AhMITE分子标记对栽培种及高世代材料进行分析，其中31对引物扩增效果比较好，每对引物可扩增1～3条带，扩增产生57条带，其中54条多态性条带，多态性条带比率94.49%。尹亮等[17]筛选出10对引物对12份材料进行鉴定，利用2%的琼脂糖凝胶电泳检测出真杂种。上述研究证明了MITE分子标记的可靠性。

分子标记用于花生杂种鉴定的报道较多，但多基于SSR。本研究通过原位胚拯救技术获得了花生不亲和种间杂种F1，并利用MITE转座子分子标记和近红外技术对其真实性进行鉴定，为原位胚拯救技术的有效性提供了分子水平的证据。

1 材料与方法

1.1 材 料

以高油酸花生品种花育963为母本，花生区组外野生种A.paraguariensis为父本，搭配杂交组合。双亲于2015年5月种植于山东省花生研究所莱西试验农场杂交圃。

1.2 原位胚拯救技术获得杂种

人工杂交程序参考《中国花生品种及其系谱》[18]。搭配IAA 2mg/mL + BAP 2mg/mL+GA 2mg/mL和BAP 4mg/mL激素组合，用浸有激素的脱脂棉球敷于花生授粉花基部，以调节激素平衡获取杂交种子。

1.3 花生样品近红外光谱采集与油酸含量预测

自杂交圃母本上收获的杂交果剥去果壳，对单粒花生种子样品进行编号，利用近红外分析仪对完整单粒花生样品进行扫描，每个样品扫描3次，取平均值。采用本课题组建立的花生单粒自然风干种子主要品质指标近红外模型预测油酸含量。

1.4 SDS法提取花生基因组DNA

用刀片切取花生碎末0.1g于1.5mL离心管中，加入200μL提取液(1mol/L Tris-HCl，0.5 mol/L EDTA，10%SDS)，用磨样器磨样后于55℃水浴锅中加热30min。加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀，12000 r/min离心20min。取100 μL上清于新的离心管，加入等体积的异丙醇，充分混匀，12000 r/min离心10min。弃上清，沉淀于管中晾干后加入50μL TE缓冲液溶解，保存于-20℃冰箱以备后用。

1.5 转座子标记引物的筛选

杂种鉴定选用9对引物(表1)，均来自Shirasawa等的报道[14]。利用这9对引物进行多态性分析，选用条带清晰稳定，有明显差异的引物用于F1代杂种鉴定。

1.6 杂种F1鉴定

以F1种子提取的DNA为模板，筛选出的引物进行PCR扩增，同时具有父母本扩增条带的样品为真杂种。PCR扩增体系(20μL)：2×Taq PCR Master Mix 10μL，正反向引物各0.5μL，ddH2O 8μL，DNA模板1μL。反应程序为94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃后延伸10min结束反应。用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

2 结果与分析

2.1 杂交种的获得

如表2所示，两个激素组合共处理了240朵花，收获了79粒种子。

表1 本文所用引物序列

表2 两个激素组合处理花朵数、收获种子数及荚果数

2.2 亲本间AhMITE1转座子多态性分析筛选

利用两个亲本材料对实验室已经合成的9对AhMITE1引物进行筛选，选取扩增条带清晰稳定，片段大小在100～500bp之间，父母本扩增产物之间存在显著差异的引物对F1代杂种进行鉴定。AhTE0254扩增条带明显，且双亲均是一条带，片段大小明显不同，故选用此引物筛选F1代真杂种。

附图 采用转座子分子标记鉴定F1杂种Fig. Identification of peanut F1 hybrids with transposon molecular markers注：M：Trans 2K DNA maker(全式金)；Fp：母本(花育963)；Mp：父本；1～79：杂种种子样品。Note: M:Trans 2K DNA maker (Trans Gen); Fp: female parent (Huayu 963); Mp:male parent;1～79: hybrid samples.

2.3AhMITE1转座子分子标记鉴定花生F1代杂种

用筛选出的引物(AhTE0254)检测79粒F1代杂种种子，F1代真杂种同时具有父母本条带，呈共显性，而假杂种只存在母本条带。发现其中35粒同时具有父母本条带，为真杂种。44粒花生仅有母本条带为假杂种，真杂种率44.3%(附图)。本实验还发现双仁果的两粒花生的检测结果是一致的，即同是真杂种或者同是假杂种。

2.4 近红外光谱分析花生油酸含量

由近红外扫描结果得知杂交样品中油酸含量显著低于高油酸花生的样品为41个(表3)，分子标记鉴定的真杂种数量为35个。其中个别花生样品经检测并不是真杂种，由于最初建立近红外模型时，选用的材料均为饱满的花生种子样品，而本试验收获的个别杂种种子较秕(表3中油酸含量粗体显示的种子样品)，可能造成这部分种子通过近红外预测的油酸含量偏低，但总体上两者结果基本一致。因此，近红外扫描结果可作为初步筛选真假杂种的一种方法，减少后期分子标记杂种鉴定的工作量。

表3 近红外扫描分析单粒花生种子油酸含量 (只列出油酸含量显著低于母本的种子)

注：a代表双仁果杂交种，且相邻的两个为同一荚果的不同种子。b代表单果仁杂交种。粗体编号的种子不饱满，通过近红外扫描估计的油酸含量并不准确。

Note: a represents individual single seeds from two-seeded pods. Adjacent numbers, for example 1a&2a, 3a&4a, were from individual two-seeded pods. b represents the seeds from one-seeded pods. Bold serial numbers were poorly-filled seeds, whose oleic acid contents estimated by NIRS were inaccurate.

3 讨 论

遗传标记指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它在作物遗传育种中有着非常广泛的应用。遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标记及分子标记等四种类型[21]，前三种遗传标记主要根据物种的外部形态特征，染色体的数目及大小和物种的贮藏蛋白，同工酶等进行区分，但这三种标记本身存在一些缺点，如多态性差、标记数目不足以及易受到外界条件的影响等。DNA分子标记是以核酸为研究对象，不受以上条件影响，且鉴定周期短，准确率高。分子标记应用于花生的研究报道已有很多，但多是利用SSR标记，其扩增产物通常需要用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。本研究中AhMITE1转座子分子标记被用于鉴定花生F1代杂种，它是一种基于PCR的分子标记，仅需要通过2%的琼脂糖凝胶电泳即可检测出杂种真假，操作简便快捷。实验所选用的材料是高油酸花生品种花育963和油酸含量较低的不亲和野生种，采用近红外光谱扫描分析单粒花生油酸含量，发现真杂种的油酸含量显著低于高油酸花生，而假杂种油酸含量与母本高油酸品种花育963相仿，与分子标记的结果基本吻合。因此认为，近红外光谱分析可作为筛选真假杂种的手段。

总之，本研究运用原位胚拯救技术获得了栽培种与不亲和野生种A.paraguariensis的杂交种子，并采用简便易行的转座子分子标记技术鉴定出真杂种，并得到近红外分析结果的支持，证明了通过原位胚拯救技术克服花生属杂交不亲和障碍的有效性。可以预期，原位胚拯救技术的应用，将加速花生不亲和野生资源的利用进程，为培育突破性的花生品种创造条件。

[1] He G, Meng R, Gao H, et al. Simple sequence repeat markers for botanical varieties of cultivated peanut (ArachishypogaeaL.)[J]. Euphytica, 2005, 142:130-136.

[2] Upadhyaya H D, Sharma S, Dwivedi S L. Chapter 1Arachis[M]// Kole C. Wild crop relatives: genomic and breeding resources, legumes crops and forages. Springer, 2011:1-19.

[3] Mallikarjuna N. Gene introgression fromArachisglabrataintoA.hypogaea,A.duranensisandA.diogoi[J]. Euphytica, 2002,124: 99-105.

[4] Mallikarjuna N, Sastri D C. Morphological, cytological and disease resistance studies of the intersectional hybrid betweenArachishypogaeaL. andA.glabrataBenth[J].Euphytica,2002,126: 161-167.

[5] Mallikarjuna N. Wide hybridization in important food legumes [M].//Jaiwal P K, Singh R P, Improvement strategies ofLeguminosaebiotechnology. Great Britain: Kluwar Academic Publishers. 2003:155-171.

[6] 封海胜,申馥玉,顾淑媛,等. 花生子房离体培养研究简报[J]. 中国油料, 1980(2):73-76.

[7] 申馥玉,朱忠学,王传堂,等. 利用果针离体培养克服花生属种间杂交不亲和的研究[J]. 中国农业科学,1991, 25(5):31-35.

[8] Shen F Y, Wang C T, Duan S F. Aspetic cultute of gynophores to obtain peanut intersectional hybrids[J]. Euphytica, 1995,81:245-249.

[9] Wang C T, Shen F Y, Qiu Q S, et al.Invitroculture of peanut (Arachissp.) pegs [J]. Tropical Agricultural Research and Extension,1999, 2(1):17-20.

[10] 申馥玉,王传堂. 花生区组间杂种二代性状鉴定[J]. 中国油料, 1992(2):14-17.

[11] Bureau T E, Wessler S R. Tourist: a large family of small inverted repeat elements frequently associated with maize genes [J]. The Plant Cell, 1992,4(10):1283-1294.

[12] 马忠友,苏京平,孙林静,等. 微型反向重复转座元件(MITE)靶区域扩增多态性：一种基于MITE的分子标记方法在水稻及其他植物上的应用[J]. 中国水稻科学, 2007,21(5):459-463.

[13] 高玉龙,桂毅杰,肖炳光,等. 烟草MITE位点间多态性(IMP)标记开发及其遗传作图应用[J]. 浙江大学学报, 2012,38(6):656-611.

[14] Shirasawa K, Koilkonda P, Aoki K, et al.Insilicopolymorphism analysis for the development of simple sequence repeat and transposon markers and construction of linkage map in cultivated peanut[J]. BMC Plant Biology, 2012,12:80.

[15] 王洁,李双铃,袁美,等. 利用AhMITE1转座子分子标记鉴定花生F1代杂种[J]. 花生学报, 2012,41(2):8-12.

[16] 王辉,李双铃,袁美,等. 利用转座子AhMITE分子标记研究花生栽培种及高世代材料亲缘关系[J]. 农业生物技术学报, 2013, 21(10):1176-1184.

[17] 尹亮,任艳,等. 利用AhMITE1转座子分子标记鉴定栽培花生杂交F1代种子真伪[J]. 山东农业科学, 2015,47(12):1-5.

[18] 禹山林. 中国花生品种及其系谱[M]. 上海:上海科学技术出版社.2008:182-198.

[19] 王传堂,唐月异,王秀贞,等. 七个高油酸花生新品种的丰产性和脂肪酸成分评价[J]. 山东农业科学, 2016,48(6):31-34.

[20] Tang Y Y, Wang X Z, et al. Evaluation of wild peanut species for fatty acid composition[J]. Journal of Today's Biological Sciences: Research & Review, 2013, 2(2):21-28.

[21] 刘长国,罗军,杨公社. DNA标记技术研究进展[J]. 黄牛杂志, 2001,27(6):41-45.

Production of Peanut Intersectional Hybrids throughinsituEmbryo Rescue Technique

QI Xue1, WANG Chuan-tang2, WANG Xiu-zhen2, WU Qi2, SUN Quan-xi2,WANG Zhi-wei2, SHAO Jun-fei3, TANG Yue-yi2*, GUAN Shu-yan1 *

(1. College of Life Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, China; 3. Wendeng Soil and Fertilizer Working Station, Weihai 264200, China)

TheArachisspecies, especially incompatible ones, though with many elite genes like high yield factors and stress tolerances, have been underutilized. To breed high oleic acid peanut cultivars with stress tolerances, Huayu963, a high-oleic peanut variety, was crossed with an incompatible species. Putative F1hybrid seeds were obtained throughinsituembryo rescue technique. MITE transposon molecular markers were utilized to identify true hybrids. The results showed that 35 seeds were true hybrids as they owned all the bands from both parents. The percentage of true hybrids was 44.3%. Near infra-red spectroscopy analysis found that oleic acid content of the true hybrids was significantly lower than that of high oleic peanut, which supported the hybridity of these seeds.

peanut; hybrid identification; transposon; molecular marker;AhMITE1

10.14001/j.issn.1002-4093.2017.01.004

2016-12-01

国家花生产业技术体系项目(CARS-14)；山东省农业科学院科技创新重点项目(2014CGPY09)

祁雪(1992-)，女，吉林延边人，吉林农业大学在读硕士研究生，主要从事花生生物技术研究。

*通讯作者：关淑艳(1971-)，女，教授，博士，主要从事生物技术与作物遗传育种研究。E-mail: 458194095@qq.com

S565.2035.1; Q321+.3

A

唐月异(1979-)，女，助理研究员，博士，主要从事花生分子育种研究。E-mail: yueyit@126.com