如何提高分光光度分析的准确度

姚进一，白晓龙，花海蓉，荣梅娟，金洁蓉，施桃红

南通科技职业学院环境与生物工程学院，江苏 南通 226007

如何提高分光光度分析的准确度

姚进一，白晓龙，花海蓉，荣梅娟，金洁蓉，施桃红

南通科技职业学院环境与生物工程学院，江苏 南通 226007

分光光度测定中，从采样、预处理、溶液配制与稀释、回归方程制作、数据计算等各个环节，都要考虑有效数字的位数是否满足要求，其对分析结果准确度有举足轻重的影响；最大吸收波长的扫描、溶液稀释方式、仪器空白值的扣除等操作环节对分析结果也会产生重要影响。

准确度；分光光度分析；有效数字；条件优化

通常说的分光光度分析，是指可见光与紫外光分光光度分析，尤其以可见光分光光度分析居多。通常是在待测溶液中加入某种显色剂，让待测物质变成有色溶液，根据最大吸收波长处溶液的吸光度(A)和浓度(C)，在一定条件下符合比尔定律，即A=KC进行测定，采用标准曲线法求出回归方程，再用代入法得出结果。

影响显色条件的因素有显色剂用量、溶液pH、显色温度、时间、基体组成、干扰物质的干扰等，一般只要按照国标方法的要求进行操作，即可不考虑外界条件的影响。但是，实际分析时的操作环节远不止这些，只有认真对待每一步操作，分析准确度才能符合要求。影响分析准确度的环节主要有4个方面。

1 样品采集和处理

采集样品前要进行合理布点，满足时间、空间代表性要求，而采样点的多少与样品的均匀性相关联[1]。液体、气体比较容易达到均匀性的要求，而固体的均匀性很差，只有增加采样点，并通过磨碎、过筛等混匀手段才能弥补不足。从样品的稳定性来讲，固体样品的稳定性大于液体与气体，气体的稳定性最差。样品的稳定性与保存时间存在依赖关系，所以气体样品采集后必须立即测定；固体样品如经过制备，其分析项目的性质又比较稳定的话，可以保存较长时间；而液体样品的保存时间、保存方法等，应根据液体样品采集的技术规范进行。

适用于分光光度分析的样品，一般要求制备成水溶液，且无色、无浑浊物、无过多背景杂质。如果水样浑浊或有色，必须要预处理。预处理的目的是将待测物质转化为可测态，浓度比较低时要浓缩以满足仪器分析灵敏度的要求，当样品中存在干扰物时还要考虑采取适当措施将其消除。通常是在样品中加入酸进行消解，加入适当试剂掩蔽干扰物。消解完毕要采用定量转移的操作方式，也就是将与样品接触的容器反复洗涤4～6次，合并洗涤液转移至容量瓶中定容，定容体积至少要达到10.00 mL，尽可能满足4位有效数字。

无论采取哪种方法预处理，都要严格按照分析方法规定的操作规程进行，特别是消解过程中不能出现蒸干和爆沸现象，定量转移时不能发生试液滴落损失，否则将会带来很大误差。消解液体样品时，量取的原始样品的量要达到4位有效数字，至少为10.00 mL，固体样品的质量至少要达到0.100 0 g，这样在计算时才不会发生有效数字的丢失。

2 溶液的配制与稀释

分光光度分析一般采用标准曲线法进行。标准溶液的配制是其中重要的一环，往往要从标准物质的称量开始。标准物质一般采用基准试剂级别，称量的质量必须要达到4位有效数字，精确到0.000 1 g[2]。有些标准溶液是先粗配后标定的，标定浓度时量取与消耗溶液的体积也要达到4位有效数字才行，所以对于整个操作中量取体积的量要进行通盘考虑。一般分光光度分析的误差为2%～5%，所以标定时滴定消耗的体积多少和终点误差的累计，有可能会超过这个允许差。以1滴滴定剂(约0.05 mL)产生的终点误差来看，若标定浓度时的滴定剂消耗体积为10.00 mL，则由此产生的体积误差为0.5%，此时还不会产生根本性影响，但对于容量分析要求不大于0.2%的误差来说，已经是不符合要求的了。一般来说，滴定终点的突跃都不能超过1滴滴定剂的体积，所以，滴定分析中消耗体积量的多少，对于分析误差的影响还是至关重要的。

配制标准溶液系列时，标准使用液体积和浓度的确定，对于分析误差的大小也会产生比较大的影响，虽然国标方法中有相关溶液的浓度和体积规定，但笔者认为国标方法中规定的体积与浓度，在许多方面尚不尽合理：有些标准使用液由于浓度过高导致量取的体积过小，容易产生较大的体积误差；而有些标准使用液由于浓度过低导致量取的体积过大，需要选取2种甚至2种以上规格的移液管才能满足要求。在制作标准曲线时，为了维持测定精密度一致，最好使用同一支移液管量取溶液，而体积过小或过大的溶液，在量取时十分不便。

标准曲线最高浓度点的标准使用液体积为多少比较合适？笔者认为最好是10.00 mL，所取标准溶液分隔体积最好分别为0、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL，这样分隔可以满足标准曲线的浓度点为7个，符合标准曲线实验点的制作要求。对于常用的规格为50 mL的比色管而言，最高与最低浓度的稀释倍数为5～50倍，吸光度大小与范围容易把控，这样，分析中只需使用一支10 mL的刻度吸管即可，这是比较理想的实验方式。

标准系列制作中，标准使用液的浓度为多少比较合适？既要满足最小体积所得浓度的吸光度在0.1以上，又能满足最大体积所得浓度的吸光度在0.7以下，根据吸光度测定误差最小原理，吸光度越接近于0.434 3，测定时浓度误差就越小[3]，所以若能满足全程吸光度在0.2～0.6之间则为最佳。所以，应允许实验人员在国标方法的基础上适当改变标准系列中所取标准使用液的体积范围(如也可以分别吸取0、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00 mL进行划分，以满足实际分析需要)，这也符合具体问题具体分析的辩证法观点。制作的标准曲线是好还是差，主要看标准曲线的线性关系如何，通常可从相关系数大小进行判断，若大于0.999，则呈现非常良好的线性关系，若低于0.999，则可对相关系数进行显著性t检验，以说明其是否合格。在试验了吸光度范围后，就可以进一步确定标准使用液的浓度大小了。目前分析人员采用的分光光度法，由于大多数还是20世纪80～90年代制定实施的，给出的标准溶液浓度有许多不尽合理之处，还需要有关部门组织专家进行专门研究与改进，使分析方法既准确合理又实用方便。

一般环境污染物浓度都比较低，所以标准使用液的浓度也很低，分析中通常要先配制一定浓度的浓溶液，再进行分级稀释。从标准溶液(母液)稀释为标准使用液的一次性稀释倍数不能太大，以不超过100倍为宜，主要考虑每次量取的标准溶液体积不要低于10.00 mL。允许的最大稀释倍数与容量瓶的规格大小有关，所以对于容积为250 mL的容量瓶最多稀释25倍，容积为500 mL的容量瓶最多稀释50倍，容积为1 000 mL的容量瓶最多稀释100倍。如果标准溶液与标准使用液的浓度相差过大(如超过100倍时)要分级稀释才能满足要求。比如，石墨炉原子吸收分析中使用的市售浓度为1.00 mg/mL的金属离子母液，要将其稀释为25.0 μg/L的标准使用液，总稀释倍数为40 000倍，若分二级稀释(200×200)则不能符合要求，若分三级稀释，其可能的分级稀释倍数划分见表1。

表1 稀释40 000倍溶液可能的分级稀释情形Table 1 The possible classification of the solution diluted 40 000 times

稀释标准溶液时，必须要考虑移液管的规格，最好是选取能够完全放出溶液的胖肚移液管量取，由此产生的体积误差最小[4]，有助于提高分析结果的准确度；另外，优先从量取标准溶液体积小的开始进行稀释，可以最大程度地减少原始母液或高浓度溶液和蒸馏水的浪费。

从表1来看，一级、二级、三级稀释倍数的乘积均为40 000倍，唯有方式5的操作稀释倍数之和最小，能够普遍地提高量取溶液的体积量，避免由于量取体积过小带来过高的相对误差，所以是最佳稀释途径。即先将标准溶液稀释25倍(一级稀释)，再稀释40倍(二级稀释)，然后再次稀释40倍(三级稀释)，选择容量瓶的规格分别为250、1 000、1 000 mL，量取浓溶液的体积分别为10.00、25.00、25.00 mL。

第二与第三级稀释时，若也选择250 mL的容量瓶，则量取的体积为6.25 mL，有效数字明显不能达到4位；若选择500 mL的容量瓶，则量取的体积为12.50 mL，虽然有效数字符合要求，但是体积(12.50 mL)需要用刻度吸管量取2次叠加，不容易做到准确量取，反而容易带来误差叠加，所以二级与三级稀释均选择1 000 mL的容量瓶比较合适。

3 仪器条件的选择与优化

对分光光度法的测定波长，许多人都是直接采用国标方法给定值进行，殊不知不同仪器在使用中由于存在不同程度的磨损，往往会产生波长读数偏差，而分光光度分析的依据是比尔定律，前提是在最大吸收波长处溶液的吸光度与其浓度成正比，在其他波长处进行测定，就会产生比较大的误差。所以，在波长选择中还存在波长优化的问题，而这些操作往往被分析人员所忽视[5-7]。容易被分析人员忽视的操作还可能有比色皿的规格是否一致，最大吸收波长在仪器上的表观值是否等于实际值，制作标准曲线时仪器空白、试剂空白、方法空白等是否符合要求，方法空白值到底是扣除还是不扣除等，这些操作如果被忽视了，就可能得不到最佳操作条件，导致测定结果产生误差[8-10]。

分光光度测定所用的比色皿必须满足规格一致的要求[11-14]，通常是装入相同的溶液(如蒸馏水或方法空白溶液，一般测定时用什么溶液作参比，就采用哪种溶液进行比对为好，这样可以免去过多的洗涤步骤)，在最大吸收波长处产生的吸光度差要不大于0.005，满足此项即可认为是同一规格[15]，因此，正式测定前一般要从多只比色皿中进行选取。为什么吸光度差要不大于0.005？因为一般分析中对标准曲线最低点的吸光度要求不低于0.100，若最低吸光度为0.100，分析误差为最大值(5%)，则吸光度的最大允许误差为0.100×5%=0.005。而选取比色皿必须要在得出待测溶液的最大吸收波长后进行才有意义，否则就脱离了比尔定律的使用前提。所以，分光光度测定时一般要按照如下3个步骤进行：

3.1 扫描最大吸收波长(λmax)

任取一只比色皿，洗净后盛入标准系列中间浓度左右的有色溶液，在国标方法给定的波长左右约10～50 nm范围内扫描出最大吸收波长(扫描时如果出现负吸光度，则按下100%按钮即可)，然后固定在此波长处测定各溶液的吸光度。值得一提的是，实际工作中甚至有个别分析人员认为最大吸收波长就是吸光度最大处的波长，这是十分错误的。最大吸收波长首先应该是一个峰的顶点，在最高峰顶点处对应的波长才对。

有些分光光度计在开机后需要预热一定时间，并放入黑比色皿挡住光路后调节透光率为0%，然后才可以进行波长扫描、比色皿选取和吸光度测量，请按照仪器说明书进行操作。

3.2 选取比色皿

比色皿经过多次使用后，由于着色、磨损等原因，原始透光情形会发生改变，由此就产生了比色皿仪器空白值的差异。分光光度测定中，一般为了避免后续测定的校正操作，只使用2只比色皿(一只作参比，一只测定溶液吸光度)。当采用2只比色皿时，由比色皿仪器空白引起的误差，在样品与标准系列测定条件完全一致的情况下，只是相当于标准曲线在吸光度纵坐标上的平移，故对测定结果没有太大影响，但是2只比色皿的规格还是应尽可能接近为好，因此需要进行比色皿的选取。

选取比色皿的方法为任取4只比色皿(新买的比色皿任选2只即可)，洗净后同时盛入参比溶液放入比色皿盒，在待测溶液的最大吸收波长处，以靠近身边的第1只比色皿调节透光率T=100%(作参比，A=0.000)，然后分别读出其余3只比色皿的吸光度，选择吸光度差值最小的2只比色皿作为测定用(一般要求吸光度差值不高于0.005，否则重新放置另外的比色皿进行选取)，此操作可以称作“4选2”；在留下的2只比色皿中再选择吸光度最小的比色皿调入身边第一格作参比(可以避免后面测定出现负吸光度)，并重新定义透光率T=100%(A=0.000)，此操作也称为“2选1”，然后拉出一格读出另一只比色皿的吸光度，此读数值即为比色皿的仪器空白值(通常要求不高于0.005，但是，若在全程测定中只使用2只比色皿，即使2只比色皿的吸光度差值高于0.005，只要不是高得太多也没关系)。如果制作的标准曲线需要在2个不同的时间使用(如想在后面几天的测定中一直使用这次制作的标准曲线)，则一定要将此比色皿的仪器空白值进行校正，方法是将回归方程的截距减去此仪器空白值，相应的样品测定数据计算，也要减去测定时的仪器空白值后再代入回归方程得出。

3.3 吸光度的测定

在参比溶液存在的前提下，用第2只比色皿分别测定其余各溶液的吸光度，注意测定中要经常核对参比溶液的吸光度是否为0.000，若不是则应随时按下100%按钮定义为0.000。连续测定的溶液浓度相差较大时，必须用欲测溶液润洗比色皿2～3次，方可测定和读取欲测溶液的吸光度。

4 分析数据的记录、计算、修约与呈报

数据记录时，要尽可能列表记录，以满足直观性要求，一定要注意有效数字的位数是否满足要求，是否和实际测量精度一致。从满足准确度的角度出发，最好都要有4位有效数字，否则就有可能对结果计算造成影响。由于吸光度只有3位有效数字，故要求记录吸光度到小数点后面第3位，而回归方程(y=bx+a)的截距(a)与纵坐标吸光度(y)是处于同一属性的数据，所以，回归方程中a值至少也要达到小数点后面的第3位才行，而通常为了提高测定准确度，计算中可以多保留1位，即满足回归方程中a值达到小数点后第4位为好。

分光光度测定往往在数据处理时要计算回归方程，可以在Excel表中进行，但首先要对表格中各数据的小数点位数进行定义(选中，点击“增加小数位数”或“减少小数位数”)，如果不进行小数点位数的定义，就可能出现有效数字位数的丢失。采用代入法计算时，要严格按照有效数字的运算规则进行计算与修约。

计算回归方程时，横坐标要优先选择数据大的或有效数字位数多的，以保持有效数字不丢失并且误差小，可以使用体积(mL)或物质的绝对含量(mg或μg)作单位。若使用质量体积浓度(mg/L)作单位，通常由于这些数据的数值比较小，容易产生比较大的数值相对误差，所以横坐标选择用什么作单位，对分析结果误差的大小也会产生影响。

使用回归方程时，一定要满足待测样品溶液与标准系列溶液在测定条件和处理数据方式上的一致。如果回归方程是扣除了空白值后得出的，则样品测定吸光度也应在扣除空白值后代入求出；如果回归方程计算时没有进行任何扣除处理，则样品测定吸光度也不能进行任何扣除处理。但是如前所述，如果此回归方程在今后几天里还想使用，则一定要满足测定条件(尤其是温度)的一致性，并且要扣除比色皿仪器空白得出回归方程，样品测定时也要事先测出当时条件下的比色皿仪器空白，然后将样品测定吸光度减去当时条件下的比色皿仪器空白，再代入回归方程得出样品结果。如果测定条件一致，而数据处理条件不一致，还是会产生很大的分析误差。一般说来，标准曲线方程的稳定时期是有限的，当测定条件变化比较大时(如温度、基体组成、实验仪器等发生变化时)，应该在每次测定样品的同时制作标准曲线，以降低测定条件不一致而产生的误差。

数据呈报时，要将计算得出的横坐标(体积或质量)单位换算为浓度单位，水质分析结果通常以质量体积浓度(mg/L)作为浓度单位。修约后的浓度数值保留小数点的位数，通常参考2种方法进行：一是察看分析方法最低检出限(浓度)在小数点后面的位数有几位，修约后保留位数与其相同，注意不能多于方法检出限到达的位数；二是参考环境标准中该项目的浓度限值所达到的位数，保留与其小数点后面的位数相同。修约时要遵循“四舍六入五留双”的修约规则进行。

5 结论

提高分光光度分析的准确度要注意以下几个方面：

首先要充分考虑分析操作环节。从采样前的布点、样品采集、样品制备，到预处理、溶液配制与稀释、分析条件选取与优化、回归方程制作、数据计算与上报等，进行系统化的考虑。

其次要注意有效数字的运用。在标准贮备液配制、标准系列溶液配制过程中的有关试剂称量、溶液量取与稀释、标准系列量取溶液的体积划分等，要进行适当的选择与优化，至少要满足4位有效数字。

再次要注意标准溶液的稀释方式与方法。在满足量取体积不小于10.00 mL的前提下，优先选择“稀释倍数之和”最小、最小量取体积优先在前的顺序依次进行稀释的方式。

最后要把握分析依据及数据处理方式。比尔定律是分光光度分析的依据，最大吸收波长是其使用前提，波长不准就会产生很大误差；而仪器空白值是否扣除以及如何扣除等操作环节，同样会对分析结果产生较大影响。

总之，分光光度分析是一个系统化的操作，从采样、预处理、条件选取、吸光度测定到数据处理等一系列操作，都要认真规范，能少一步操作的就不要多，能不加的试剂就不要加，能不用的仪器就不用，最大程度地减少接触沾污，减少干扰物来源。只有对整个分析方法全面把握，并在测定中细心操作，充分把握误差环节，始终树立有效数字的意识要求，才能确保分析结果客观准确，满足分析误差达到最小化的要求。

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Study on How to Improve the Accuracy of the Spectrophotometric Analysis

YAO Jinyi,BAI Xiaolong,HUA Hairong,RONG Meijuan,JIN Jierong,SHI Taohong

Faculty of Environmental and Bioengineering,Nantong College of Science and Technology,Nantong 226007,China

In the spectrophotometric measurement, it is important to consider the number of significannce digits in the process of sampling, pretreatment, solution preparation and dilution, regression equation, data calculation and other aspects, which has a significant impact on the accuracy of the analysis results. The maximum absorption wave length of scanning, solution dilution method and the calculation of the blank value of the instrument will have a profound impact on the analysis results.

accuracy;spectrophotometric analysis;significannce digit;condition optimization

2015-11-30;

2016-02-16

姚进一(1962-)，男，江苏南通人，硕士，副教授。

X830.2

A

1002-6002(2017)02- 0116- 06

10.19316/j.issn.1002-6002.2017.02.18

分光光度分析在环境监测中占有十分重要的地位，许多监测单位有50%以上的常规项目采用分光光度分析。但是，在实际工作中即使是工作年限很长的分析人员，有很多都不会主动思考如何提高分光光度分析的准确度。