采用花器喷雾法并基于Cre/lox系统定点整合拟南芥Rps2基因的技术体系研究

李定红， 张艳梅， 周广灿， 雷 照， 孙小芹， 杭悦宇

〔江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园)， 江苏 南京 210014〕

采用花器喷雾法并基于Cre/lox系统定点整合拟南芥Rps2基因的技术体系研究

李定红， 张艳梅， 周广灿， 雷 照， 孙小芹①， 杭悦宇①

〔江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园)， 江苏 南京 210014〕

定点整合是一种指导目的基因以精确单拷贝进入基因组预定位点的转基因技术，用于解决常规转基因技术带来的系列问题[1-2]。在拟南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕中，已通过根外植体法转化实施了基因的定点整合[3]，但这一过程存在杂菌污染、分化困难和生长周期长等问题，且定点整合效率极低[3]，无法进行推广应用。花器喷雾法是一种不依赖于组织或细胞培养而直接在活体植株中进行转基因的方法，在拟南芥中通过该法获得的随机整合效率达1.33%～2.41%[4]，是拟南芥最高效的转基因方法。

Rps2基因是拟南芥的单拷贝抗病基因[5]，介导对携有avrRpt2基因的细菌病原物的抗病性；拟南芥rps2-101C生态型是Col-0生态型经EMS辐射筛选的突变体植株[5]，对avrRpt2基因无抗性。作者以rps2-101C生态型为转基因背景材料，通过花器喷雾法实施Cre/lox系统介导的Rps2基因的定点整合，以期对拟南芥的定点整合技术体系进行改进，并为加快植物基因功能和定向育种的研究提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

质粒pSDM3110[3]由荷兰莱顿大学的Hooykaas博士提供，该质粒包含1个lox位点和由35SCaMV启动子调控的Cre编码区形成的嵌合结构。农杆菌株系GV3101、拟南芥rps2-101C生态型以及3种交换载体p1301-lox-nptⅡ、p1301-lox-nptⅡ-Rps2和p1301-lox-nptⅡ-rps2[6]由美国芝加哥大学Bergelson博士提供；p1301-lox-nptⅡ载体含有在2个lox位点间插入无启动子的nptⅡ基因编码区和终止子的结构，p1301-lox-nptⅡ-Rps2和p1301-lox-nptⅡ-rps2载体则是在p1301-lox-nptⅡ载体的nptⅡ基因终止子后分别插入Rps2抗病基因和rps2感病基因的全长序列。

1.2 方法

1.2.1 转化和筛选 采用电穿孔法[7]将质粒pSDM3110转入农杆菌中；将拟南芥rps2-101C生态型在温室中栽培至开花，采用花器喷雾法[4]进行转化；T0代种子萌发后经Basta(德国AgroEvo公司)喷洒进行筛选；保留T1代抗性植株并培养至开花，自交后子代幼苗用Basta筛选，存活率约为75%的T1代植株即为单拷贝转化植株。pSDM3110的T-DNA区域在基因组中的转入位置用Vectorette Ⅱ试剂盒(美国Sigma-Aldrich公司)通过锚定PCR确定，基于T-DNA基因组定位信息通过3-引物PCR[8]鉴定转基因植株的杂合状态。

将筛选的转基因杂合体植株用花器喷雾法[4]分别进行交换载体转化，以p1301-lox-nptⅡ载体转化rps2-101C生态型为空白对照。获得的种子经卡那霉素筛选，自交2代后其子代表现100%卡那霉素抗性的植株即为转基因纯合体植株。

1.2.2 等位基因系的表型与遗传验证 针对交换载体和侧翼序列设计引物。由于定点整合后Bar和Cre间的nptⅡ表达框被活化，因此，针对2个发生精确整合的lox位点两侧序列设计引物A和B，分别扩增出1.0和1.1 kb的片段；若存在随机整合的转基因拷贝，引物C将扩增出0.6 kb的片段。

根据Jefferson等[9]的方法，通过组织化学染色法测定GUS(β-葡糖醛酸酶)在植株中的活性，从而检测转基因植株中是否存在随机T-DNA整合。采用EXPRESS Two-Step SYBR®GreenERTM试剂盒(美国Invitrogen公司)进行qRT-PCR检测；Rps2引物结合于基因末端(位于2 730个碱基中的第2119位至第2314位)，以EF1a为实验内参[10]。采用丁香假单胞菌DC3000：avrRpt2接种拟南芥植株进行过敏反应测试；并根据植株感病症状参照文献[11]的标准进行过敏反应分级，抗病记为“2”、中度抗病记为“1”、感病记为“0”。

2 结果和分析

2.1 定点整合体系的构建

基于Cre/lox系统的拟南芥Rps2基因的定点整合基本流程见图1。由图1可见：携带lox靶序列的拟南芥转基因植株被分别转入交换载体(p1301-lox-nptⅡ、p1301-lox-nptⅡ-Rps2和p1301-lox-nptⅡ-rps2)中，在交换载体上位于2个lox位点间的序列在Cre重组酶作用下被环化，随之被定点整合到基因组中预先转入的lox表达框。定点整合阻断了Cre编码区转录使之终止表达，而交换载体中nptⅡ基因受35S启动子调控恢复正常表达，用于定点整合植株的筛选。

： 分别表示引物A、B和C的结合位点 Representing binding sites of primer A， B and C， respectively； ： 表示lox位点，箭头方向指示lox位点的方向 Representing lox site， the arrow’s direction indicating the direction of lox site； ： 分别表示T-DNA的左、右边界Representing left and right borders of T-DNA， respectively； ： 分别表示基因编码区及其启动子和终止子 Representing gene coding region and its promoter and terminator， respectively.图1 由Cre/lox介导的拟南芥Rps2基因的定点整合基本流程图Fig. 1 Basic flow chart of site-specific integration of Rps2 gene mediated by Cre/lox in Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.

2.2 转基因杂合体植株的筛选

经Basta筛选，共获得3个转lox靶序列的单拷贝植株系；T-DNA基因组定位显示这3个转基因株系的基因组转入位点不同，分别为第Ⅲ号染色体的4 289 059位点、第Ⅱ号染色体的13 898 787位点和第Ⅴ号染色体的18 136 204位点，分别被命名为P、Y和G株系。

2.3 定点整合植株的筛选及验证

经卡那霉素筛选，共获得1 495株定点整合候选植株，定点整合率约0.076%。在空白对照中，载体p1301-lox-nptⅡ转化rps2-101C生态型未获得卡那霉素抗性苗，说明确实是由交换载体中的lox结构与预先转入基因组中的lox发生整合而产生了卡那霉素抗性苗。

PCR实验结果表明：在1 495株定点整合候选植株中，86.04%的植株采用引物A和B分别扩增出1.0 和1.1 kb的片段，但用引物C无扩增产物，表明这些植株是经精确的定点整合产生的。同时，经组织化学染色，约63.34%的候选植株未呈现蓝色，表明没有发生额外的随机整合。

qRT-PCR检测结果表明：与转化p1301-lox-nptⅡ载体的株系相比，转化p1301-lox-nptⅡ-Rps2和p1301-lox-nptⅡ-rps2载体的株系转录水平更高(P<0.05)。此外，过敏反应实验(表1)结果表明：转化p1301-lox-nptⅡ-Rps2载体的株系过敏反应比其他2个株系更明显(P<0.01)，从而证实定点转入的Rps2基因可正常转录和表达。

载体Vector各株系的HR分级 HRgradeofdifferentlinesP株系PlineY株系YlineG株系Glinep1301-lox-nptⅡ0.67±0.070.37±0.050.25±0.02p1301-lox-nptⅡ-Rps21.91±0.091.87±0.052.01±0.05p1301-lox-nptⅡ-rps20.14±0.010.56±0.060.78±0.07

3 讨论和结论

虽然植物定点整合技术可解决常规转基因技术中转入基因表达易变的问题，但基于细胞或组织培养体系的植物定点整合技术体系的转化效率通常很低，如拟南芥根外植体法的定点整合率仅0.000 1%～0.001%[3]，水稻(OryzasativaLinn.)基因枪法仅获得1株定点整合植株[12]，烟草(NicotianatabacumLinn.)PEG法的定点整合率仅0.000 12%[2]等。作者通过花器喷雾法并基于Cre/lox系统对拟南芥定点整合技术体系进行了改进，其定点整合率达0.076%，较Vergunst等[3]报道的定点整合率高2至3个数量级，极大地提高了定点整合的效率，且操作流程简单易行，可改善定点整合技术效率低的现状。

Vergunst等[3]在利用根外植体法进行拟南芥定点整合的过程中观察到少量幼苗叶片发生脱绿现象，表现出卡那霉素敏感症状。本研究也观察到极少量幼苗具有叶片脱绿现象，推测可能是在幼苗生长过程中，一些以杂合状态存在的Cre基因编码的重组酶又将nptⅡ基因切除下来，从而使部分细胞丧失卡那霉素抗性，因此，作者仅保留了子代具有完全卡那霉素抗性的候选植株用于进一步分析。

利用改进的Cre/lox定点整合体系，成功介导Rps2基因准确插入拟南芥基因组的预定位点，定点整合效率大幅提高，定点整合的Rps2基因正常转录和表达，因此，应用本体系可极大提高植物定点整合遗传转化体系的稳定性和转化效率。

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(责任编辑： 郭严冬)

Technology system research on site-specific integration ofRps2 gene inArabidopsisthalianabased on Cre/loxsystem by floral spraying method

LI Dinghong， ZHANG Yanmei， ZHOU Guangcan， LEI Zhao， SUN Xiaoqin①， HANG Yueyu①

(Institute of Botany， Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences， Nanjing 210014， China)，

J.PlantResour. &Environ.， 2017， 26(1)： 104-106

To improve site-specific integration technology system， site-specific integration ofRps2 target gene inArabidopsisthaliana(Linn.) Heynh. was carried out based on Cre/loxsystem by floral spraying method. The results show that 1 495 site-specific integration candidate plants are obtained by this method with a site-specific integration efficiency of about 0.076%. After PCR and histochemical staining experiment verification， the positive plants of precise integration account for 86.04%， in which， 63.34% positive plants are single copy transformed plants. The results of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and hypersensitive reaction (HR) show that the site-specific integratedRps2 gene can be transcribed and expressed normally. It is suggested that this system can greatly improve the stability and efficiency of site-specific integration genetic transformation system in plants.

Cre/lox系统；Rps2基因； 定点整合； 拟南芥； 花器喷雾法

Cre/loxsystem；Rps2 gene； site-specific integration；Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.； floral spraying method

2016-09-08

江苏省科技计划项目(省属公益类科研院所能力提升)(BM2015019)； 江苏省自然科学基金资助项目(BK2010476)； 江苏省植物迁地保护重点实验室开放基金项目(迁201202)； 江苏省中国科学院植物研究所青年基金项目(SQ201404)

李定红(1991—)，女，安徽滁州人，硕士研究生，主要从事植物分子遗传与进化方面的研究。

①通信作者E-mail： xiaoqinsun@cnbg.net； hangyueyu@cnbg.net

Q785； Q949.748.3

A

1674-7895(2017)01-0104-03

10.3969/j.issn.1674-7895.2017.01.14