热休克蛋白90α荧光免疫层析检测方法的建立

王云龙 李 娜 李玉林 王继创 程 蕾 高玉红

(郑州大学生命科学学院，郑州450001)

热休克蛋白90α荧光免疫层析检测方法的建立

王云龙 李 娜 李玉林①②王继创①②程 蕾①②高玉红②③

(郑州大学生命科学学院，郑州450001)

目的：建立人血清中热休克蛋白90α(HSP90α)的荧光免疫层析定量检测方法。方法：采用荧光免疫层析技术，对荧光微球制备、最佳反应时间、线性范围、精密性、回收率、临床检测等方面进行系统研究。结果：确定了各反应条件，最佳反应时间为5 min。线性范围0.39～100 ng/ml。精密性质控品高值(30 ng/ml)CV=8.14%；低值(10 ng/ml)CV=9.26%，高、中、低值血清的回收率为100.56%、99.76%、94.1%；与国外试剂盒(ELISA检测方法)平行检测40份临床血清，结果显示两者相关系数为0.968 5。结论：初步建立的方法具有良好的精密性和线性，临床符合率能满足临床检测技术要求，有望完善后报批用于临床。

荧光免疫检层析法；热休克蛋白90α；荧光微球活化

热休克蛋白90α (Heat shock protein 90α，HSP90α)是细胞受应激原刺激后诱导产生的应激蛋白[1]，在肿瘤组织中HSP90α表达量是健康组织的2～10倍[2]。其在血液中的含量与肿瘤恶性程度呈正相关[3]。Hsp90α作为一种全新肿瘤标志物[4]，用于肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌等多个肿瘤的临床检测[5,6]。患者血浆中HSP90α含量的高低与病情变化有较好的对应性[7]，可实时、较准确地反映治疗效果，可为医生提供临床诊断、治疗、预后客观依据。鉴于此，HSP90α的检测技术是目前国内外领域内研究的热点，技术上已有酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法、免疫比浊法、化学发光法等用于临床的报道[4,8]，但缺乏可用于床旁检测的荧光层析检测方法。本实验针对此方法进行系统研究。

1 材料与方法

1.1 材料 HSP90α抗体线性参考品P1-P11(依次为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.195 ng/ml和0 μg/ml)、精密性质控品L1L2分别为30 ng/ml和10 ng/ml、HSP90α配对抗体、羧基荧光微球、硝酸纤维素膜、玻璃纤维棉、羊抗鼠多克隆抗体均由河南生物工程技术研究中心提供，人HSP90α重组蛋白抗原购自武汉三鹰，抗HSP90α抗体检测对照试剂盒购自加拿大StressMarq,Victoria，临床血清标本由郑州大学第一附属医院提供，无溶血，乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病(C5项)检测阴性，其他化学试剂均为分析纯。三维平面点膜喷金仪(上海金标生物科技)、超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、荧光检测仪[艾维博特(天津)生物科技有限公司]、电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验组分 按照河南省生物技术研究中心已建立的技术方法确定的羧基荧光微球、硝酸纤维素膜、玻璃纤维棉、HSP90α配对抗体、羊抗鼠多克隆抗体，荧光微球的标记、包被按文献[9]进行。

1.2.2 荧光微球的活化条件确定 (1)取硼酸缓冲液(0.05 mol/L，pH8.2)，加入10 μl羧基微球，混匀后加入10 μl EDC溶液(10 μg/ml)，漩涡混匀器混匀活化15 min。然后离心(16 000 r/min,10 min)，弃上清，在沉淀中加入500 μl硼酸缓冲液(0.05 mol/L，pH8.2)，进行超声分散。(2)超声分散功率和时间选用以下条件：100 W，2 min；100 W，4 min；100 W，6 min。300 W，2 min；300 W，4 min；300 W，6 min；分散后加入抗HSP90α单抗5 μl，振荡偶联2 h。(3)加入55 μl，10倍浓缩封闭液振荡2 h，然后离心(16 000 r/min,10 min)，弃上清，加入复溶液1 000 μl，2 000 μl，3 000 μl，再按照上述条件进行再次超声分散。(4)将免疫微球溶液每100 μl 铺3 cm长度微球垫。放在恒温干燥箱37℃干燥2 h。

1.2.3 最佳制备工艺的研究

1.2.3.1 包被 (1)把PVC板中间黏性纸揭掉，将NC膜组装在PVC板上；(2)HSP90α多抗和羊抗鼠稀释到1 mg/ml分别作为T线和C线；(3)用三维喷金划膜仪将包被抗体和羊抗鼠以1 μl/cm的量划在硝酸纤维素膜上；(4)将包被好的NC膜放入电热恒温干燥箱37℃干燥2 h。

1.2.3.2 组装 在PVC底衬上端粘贴吸水纸，下端粘贴样品垫，吸水纸内端与样品垫内端各自与硝酸纤维素膜一段重叠，在样品垫与硝酸纤维素膜的中间夹置粘贴结合垫。用切条机将组装完成的PVC板切割成3.9 mm宽的条，放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。

1.2.4 反应模式的确定 滴加样品P1的试纸条分别在反应2、3、4、5、6、7 min后进行检测，观察到检测结果。

1.2.5 性能评价

1.2.5.1 线性范围的确定 取荧光微球免疫层析实验最佳工艺试纸条，以荧光定量检测仪读数为纵坐标，定值血清参考品(P1-P11)浓度为横坐标，分别检测3次，分别取多于5个点，绘制标准曲线，选择最佳线性范围。

1.2.5.2 精密性检测 取精密性质控品血清L1L2各20份，对同一批HSP90α荧光免疫检测试纸条进行检测，检测3次计算批内精密性。精密性CV=SD/平均数×100%。

1.2.5.3 回收率实验 用HSP90α低值血清稀释高值血清获得预测浓度为100、50和20 ng/ml的3份血清，通过线性参考品标定这3份血清，通过公式:回收率=测定浓度/预测浓度×100%，计算所制备的HSP90α检测试剂的回收率。

1.2.5.4 对比实验 以建立的人HSP90α荧光免疫层析定量检测方法，与抗人HSP90α检测 (ELISA)试剂盒(StressMarq,Victoria,Canada)平行检测40份临床癌症患者血清标本，评价制备的荧光免疫层析定量检测方法的检测效果。

2 结果

2.1 荧光微球活化实验结果对比 超声功率100 W和超声时间2 min，加入复溶液3 000 μl时的线性效果最好，检测范围0.78～50 ng/ml时，Height T/C R2达到0.975 4。见表1。

2.2 最优检测时间 滴加样品后5 min进行检测，线性范围最佳。

2.3 精密性 用建立的HSP90α定量检测方法及精密性质控品L1和L2，分别对同批次的荧光免疫层析试纸条进行精密性检测，L1批内精密性检测结果：均值28.98；SD值2.36；CV值为8.14%。L2批内检测结果：均值9.82；SD值0.91；CV值为9.26%。CV%均低于10%，符合精密性要求。CV%均低于10%。

2.4 线性范围确定 对峰高数据分析，如图1,R2=0.984 1，试纸条最佳线性范围为0.39～100 ng/ml。

2.5 回收率实验 用低值血清稀释高值血清获得的高中低值3份血清进行回收率检测。结果显示如表2，高值血清的回收率为 100.56 %;中值血清的回收率为99.76%;低值血清的回收率为94.1%，满足回收率85%～115%的要求。

表1 微球活化实验线性检测结果

Tab.1 Linear test results of fluorescent microsphere activation

NumberUltrasonicpowerandtimeComplexsolutionaddition(μl)HeightT/CR2AreaT/CR21100W,2min10000.950.952100W,4min10000.940.933100W,6min10000.920.914300W,2min10000.880.895300W,4min10000.870.776300W,6min10000.750.767100W,2min20000.9620.968100W,4min20000.930.929100W,6min20000.900.8910300W,2min20000.870.8611300W,4min20000.860.8512300W,6min20000.820.8013100W,2min30000.970.9714100W,4min30000.880.8715100W,6min30000.780.7616300W,2min30000.830.8217300W,4min30000.760.7518300W,6min30000.730.72

图1 Height 标准曲线Fig.1 Height sandard curve

表2 回收率结果

Tab.2 Recovery result

GroupsPredictedconcen-tration(ng/ml)concentrationdeter-mination(ng/ml)Recovery(%)Highrecovery1001100.56Medium50499.76Low20194.10

2.6 临床相关性检测 结果如图2，两者具有很好的相关性，相关方程为：Y=0.919 4x+1.083 3,R2=0.968 5。

图2 荧光层析与ELISA诊断试剂盒试剂盒测定结果的相关性Fig.2 Linear correlation between constracted immunochromatographic assay and ELISA measureme-nt assay

3 讨论

荧光层析检测方法是在荧光染料标记技术上发展起来的[10]，荧光染料发射光谱型标记物，信号强度可随激发光增强而增强，在理论上有效降低了层析方法的检测限。具有检测快速、稳定性好、重复性好、既可定性又可定量等优点[11-13]，本实验统计学方法参考《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则(征求意见稿)》，检测方法与ELISA诊断试剂盒对比相关性良好，有可能为临床检测提供一种准确可靠的检测方法，并有望在临床检测上进行推广形成系列试剂，提升整个诊断试剂行业的技术水平。在本实验中荧光微球聚集不容易分散是困扰该方法建立的一大难题，我们借鉴超声技术不同的功率和时间可以造成不同的清洗效果原理[14]，选择一定范围的功率和作用时间进行超声处理，获得良好的实验效果(设置超声功率100 W和超声时间2 min)。率先利用超声清洗技术进行微球活化具有创新性，可作为其他研究的借鉴。

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[收稿2016-12-30 修回2017-02-20]

(编辑 张晓舟)

Establishment of quantitative fluorescence immunochromatographic assay detection method for heat shock protein 90α(HSP90α)

WANGYun-Long,LINa，LIYu-Lin,WANGJi-Chuang,CHENGLei，GAOYu-Hong.

SchoolofLifeScience,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China

Objective:To establish quantitative a fluorescence immunochromatographic assay detection method for the heat shock protein 90α(HSP90α)in human serum.Methods: Indirect the technology of fluorescence microshers immunochromatographic assay was used to research fluorescent microsphere activation,ensure optimal testing time,determine linearity range,precision,recovery experiments,testing clinical samples and that sort of thing in the fluorescence immunochromatographicassay experiment.Results: In all the reaction conditions,it was determined that the optimal teaction time was 5 minutes,and in the best line range (0.39-100 ng/ml) precision quality control materials of high recovery (30 ng/ml) Intra-assay CV was 8.14%; quality control materials of low recovery (10 ng/ml) Intra-assay CV was 9.26%.With high,medium and low recovery of serum recovery was 100.56%,99.76%,94.1%,separately.Foreign kit(ELISA) for detection of 40 cancer patients clinical serum,the result showed that the correlation was 0.968 5.Conclusion: Establishing the method initially quantitative fluorescence immunochromatographic assay for the heat shock protein 90α(HSP90α)in human serum have high performance and linear,clinic accordance rate also can satisfy the demand of clinic quantitative detection，and will improve hopeful to applied to clinic after apprroved.

Fluorescence immunochromatographic assay detection method;Heat shock protein 90α (HSP90α);Fluorescent microsphere activation

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.016

王云龙(1962年-)，男，教授，博士生导师，主要从事生物制药方面的研究，同时就职于河南省生物工程技术研究中心，E-mail:biowyl@126.com。

R446.6

A

1000-484X(2017)05-0712-04

①河南省生物工程技术研究中心，郑州450010。

②郑州市生物制药重点实验室，郑州450010。

③郑州职业技术学院，郑州450010。