过表达Oct4B1诱导结直肠癌SW480细胞发生上皮间质转化①

陈奕霖 文坤明 胡水清 陈正权 曾庆良

(遵义医学院附属医院胃肠外科，遵义563000)

过表达Oct4B1诱导结直肠癌SW480细胞发生上皮间质转化①

陈奕霖 文坤明 胡水清 陈正权 曾庆良

(遵义医学院附属医院胃肠外科，遵义563000)

目的：探讨Oct4B1基因过表达是否诱导人结直肠癌SW480细胞发生上皮间质转化(EMT)及其可能的机制。方法：用带G418抗性的Oct4B1基因过表达质粒及阴性对照质粒转染人结直肠癌SW480细胞株，分别称为实验组(SW480-Oct4B1)及对照组(SW480-NC)，转染成功后用G418筛选建立稳定转染的细胞株，对两种稳定转染细胞进行如下检测：① RT-qPCR检测Oct4B1的mRNA水平；②划痕实验和Transwell小室实验检测迁移和侵袭能力；③Western blot检测EMT相关标记物E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白表达；④RT-qPCR和Western blot检测EMT转录因子Twist的mRNA及蛋白表达。 结果：稳定转染细胞株建立后，实验组与对照组比较：Oct4B1基因表达水平明显升高(P<0.01)；细胞迁移明显增强(P<0.01)；细胞侵袭能力明显提高(P<0.01)；上皮标记物E-cadherin蛋白表达量明显下降(P<0.01)；而间质标记物N-cadherin及Vimentin蛋白表达量明显上调(P<0.01)；Twist 的mRNA及蛋白表达量均明显升高(P<0.01)。结论：过表达Oct4B1基因可诱导人结直肠癌SW480细胞发生EMT，增强细胞迁移及侵袭能力，其分子机制可能与提高Twist表达有关。

结直肠癌细胞；Oct4B1；上皮间质转化；Twist

Oct4不但是调控胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ES)特性的重要转录因子[1]，研究还发现Oct4参与肿瘤干细胞(Cancer stem cells，CSCs)及肿瘤细胞上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transitions，EMT)过程的调控[2,3]。Oct4B1作为Oct4重要的亚型，在结直肠癌及胃癌等肿瘤细胞中高表达，具有抗肿瘤细胞凋亡的作用[4,5]，Oct4B1是否调控肿瘤细胞EMT过程，目前鲜见文献报道。本研究拟过表达人结直肠癌SW480细胞中的Oct4B1基因，明确Oct4B1基因是否能够诱导人结直肠癌SW480细胞发生EMT及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人结直肠癌SW480细胞株购于中国科学院上海细胞库；L-15培养基购于北京迈晨生物有限公司;胎牛血清(FBS)购于美国 Hyclone公司；带G418抗性的Oct4B1过表达质粒及阴性对照质粒于上海吉凯基因化学技术公司构建；LipofectamineTM2000购于美国Invitrogen公司；Transwell小室购于加拿大Biofil公司；Matrigel胶购于美国Clontrch公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、SYBR TAQ Real time试剂盒购于大连TaKaRa公司；细胞全蛋白提取试剂盒购于南京凯基公司；兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimenti、Twist一抗购于美国Eptomics公司；G418购于美国Sigma公司；鼠抗人GAPDH一抗及山羊抗兔、山羊抗鼠二抗购于北京中杉金桥公司。

1.2 方法

1.2.1 瞬时转染实验 转染步骤：①将人结直肠癌SW480细胞于含10%FBS的L-15培养基中培养，待细胞生长状态良好时，用于转染实验；②将呈对数生长期的SW480细胞1×106/孔接种于6孔板，按说明书用LipofectamineTM2000 转染试剂盒将带G418抗性的Oct4B1过表达质粒及阴性对照质粒转染到该细胞中分别得到实验组(SW480-Oct4B1)与对照组(SW480-NC)；③转染后48 h收集两组细胞，提取RNA并逆转录成cDNA，用RT-qPCR检测Oct4B1 mRNA的表达水平(具体方法见1.2.5)，确定Oct4B1过表达质粒的瞬时转染效果。

1.2.2 构建稳定转染细胞株 (1)因质粒带G418抗性基因，在构建稳定转染细胞株前首先检测G418对SW480细胞的最佳作用浓度：①将SW480细胞接种于24孔板(1×105个/孔)中培养，待融合度达80%用于最佳G418浓度的筛选；②用含10%FBS的 L-15 培养基配制成含不同浓度梯度的G418培养基(0、200、400、800及1 600 μg/ml)分别加入到各孔中，观察细胞凋亡情况，确定最佳的G418浓度。(2)用前述最佳作用浓度的G418加入到瞬时转染质粒后的两组细胞的培养液中，未转染的细胞因G418作用而凋亡，成功转染的细胞因带G418抗性而存活下来，逐步筛选得到的稳定转染的细胞株，用于后续实验，所有实验均重复3次以上。

1.2.3 细胞迁移能力检测 将稳定转染后的细胞株接种于6孔板(1×106个/孔)中培养，待铺满孔板后用针头(1 ml注射器)垂直划出间距约0.5 mm均匀直线，用PBS清洗后继续培养，观察12 h和24 h后细胞在划线处伤口愈合的情况，用愈合率来反映细胞的迁移能力。

1.2.4 细胞侵袭能力检测 实验前12 h用无血清培养两组细胞使其处于饥饿状态，按说明书用无血清培养基把Matrigel胶稀释为2 mg/ml，把Transwell小室放于24孔板后在小室中加入100 μl稀释后的Matrigel胶，于37℃培养箱中静置4 h，在24孔板(下室)加入含20%FBS的L-15培养基600 μl，在Transwell小室(上室)中加入用无血清培养基制备好的细胞浓度为1×105个/ml的细胞悬液250 μl，培养24 h后取出Transwell小室去掉基质胶表面残留的细胞，用2%结晶紫染色，在显微镜下随机观察四个视野求得每个视野穿膜细胞数平均值，通过穿膜细胞数反映其侵袭能力。

1.2.5 RT-qPCR 细胞刮刮取两组细胞，RT-qPCR 法检测目的基因的mRNA水平：①按说明书用RNA提取试剂盒提取细胞的RNA；②逆转录合成cDNA；③SYBR Green染料法进行实时定量PCR反应。反应条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，59℃ 30 s，40个循环；65℃ 5 s，95℃ 5 min；绘制熔解曲线，每次检测设立3个复孔，重复3次。选择GAPDH基因为内参，运用2-ΔΔCt法确定目的基因的相对表达水平[3]。引物序列见表1，由大连宝生物公司设计并构建。

1.2.6 Western blot检测蛋白表达 细胞刮刮取两组细胞，Western blot法检测相应蛋白表达：①按说明书用全蛋白提取试剂盒提取细胞蛋白，-80℃冻存备用；②每孔上样量均为40 μg, 根据目的蛋白的分子量予以相应浓度SDS-PAGE胶分离蛋白，用湿法转膜(1 kD/min)将目的蛋白转移至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h后用PBST洗涤3次，加入一抗稀释液(目的蛋白稀释比例均为1∶2 000，内参GADPH为1∶1 000)，4℃过夜孵育；次日用PBS洗膜后加入相应的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗稀释液(二抗均为1∶5 000稀释)，室温孵育1 h后PBS洗膜，用ECL发光并拍照。采用Image-Pro Plus软件对条带的吸光度值进行半定量分析。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

GeneUpstreamDownstreamOct4B15'-AATCCCGAATGGAAAGG-3'5'-GGAACCCACCAAATAGAAC-3'Twist5'-AGCAAGATTCAGACCCTCAAGC-3'5'-CTCCATCCTCCAGACCGAGAA-3'GAPDH5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'5'-TGAGAAAGGAGACCCAGCAG-3'

2 结果

2.1 RT-qPCR检测瞬时转染后两组细胞Oct4B1 mRNA表达情况 瞬时转染后48 h，采用RT-qPCR检测两组细胞中Oct4B1 mRNA表达水平，结果实验组较对照组提高了1.3倍，提示瞬时转染成功。

2.2 稳定转染株的构建 G418对SW480细胞的最佳作用浓度为800 μg/ml，在含10%FBS的 L-15 培养基中加入该浓度的G418筛选瞬时转染成功的两组细胞，经筛选成功建立了稳定转染细胞株(见图1A)。稳定转染细胞株建立后，实验组较对照组细胞的Oct4B1 mRNA表达水平提高了1.8倍，实验组明显高于对照组(P<0.01)，见图1B。

2.3 细胞迁移能力检测结果 实验组与对照组12 h 在划线处伤口愈合率分别为(45.0±1.2)%和(34.3±1.2)%，继续培养至24 h在划线处伤口愈合率分别为(54.0±1.0)%和(42.0±1.5)%，发现实验组伤口愈合率均明显高于对照组(P<0.01)，见图2，提示实验组迁移能力明显强于对照组。

图1 RT-qPCR检测稳定转染后两组细胞Oct4B1 mRNA表达情况Fig.1 Expression of Oct4B1 mRNA in two groups after stable transfection was detected by RT-qPCRNote: Compared with SW480-NC，*.P<0.01.

2.4 细胞侵袭能力检测结果 培养24 h后发现实验组和对照组穿膜细胞数分别为(568.7±20.2)和(398.0±11.0)，实验组穿膜细胞数明显高于对照组(P<0.01)，见图3，提示实验组细胞侵袭能力强于对照组。

2.5 Western blot检测EMT标记物蛋白表达水平 实验组和对照组中E-cadherin蛋白表达分别为(0.39±0.01)和(0.55±0.02)，N-cadherin蛋白表达分别为(0.89±0.03)与(0.61±0.02)，Vimentin蛋白表达分别为(1.16±0.04)与(0.68±0.03)，实验组上皮标记物E-cadherin蛋白表达量明显低于对照组(P<0.01)，而间质标记物N-cadherin及Vimentin表达量显著高于对照组(P<0.01)，见图4，以上结果提示实验组相对于对照组细胞发生EMT。

2.6 RT-qPCR检测稳定转染后Twist mRNA表达情况 稳定转染细胞株建立后，实验组较对照组细胞的Twist mRNA表达水平提高了2.1倍，实验组明显高于对照组(P<0.01)，见图5。

图2 划痕实验检测12 h和24 h两组细胞的愈合率(×100)Fig.2 Healing rate of two groups of cells was detected by scratch test after 12 h and 24 h(×100)Note: Compared with SW480-NC，*.P<0.01.

图3 Transwell小室检测两组细胞24 h细胞穿膜细胞数(×100)Fig.3 Cell transmembrane number of two groups of cells was detected by transwell assay after 24 h(×100)Note: Compared with SW480-NC，*.P<0.01.

图4 Western blot检测两组细胞E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白表达Fig.4 Expression of E-cadherin,N-cadherin and Vimentin protein in two groups of cells was detected by Western blotNote: Compared with SW480-NC，*.P<0.01.

图5 RT-qPCR检测稳定转染后两组细胞Twist mRNA表达情况Fig.5 Expression of Twist mRNA in two groups after stable transfection was detected by RT-qPCRNote: Compared with SW480-NC，*.P<0.01.

图6 Western blot检测两组稳定转染细胞Twist蛋白表达Fig.6 Expression of Twist protein in two groups of cells was detected by Western blotNote: Compared with SW480-NC，*.P<0.01.

2.7 Western blot检测Twist蛋白表达情况 稳定转染细胞株建立后，实验组和对照组中Twist蛋白表达相对水平分别为(0.68±0.02)与(0.40±0.02)，实验组较对照组显著增高(P<0.01)，见图6。

3 讨论

结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是发病率及死亡率均较高的恶性肿瘤[6]，术后复发、转移是其治疗失败的主要原因。研究发现EMT与恶性肿瘤复发、转移密切相关[7]。EMT指的是一个复杂的分子和细胞程序，在这一过程中，上皮细胞失去细胞的极性及细胞间黏附能力，且使得细胞缺乏运动的特性，而获得间质细胞的特性，如运动能力、侵袭力及抗凋亡的能力[8]。EMT的发生由肿瘤微环境中的间质细胞释放相关信号激活EMT转录因子而触发。参与EMT的转录因子包括Snail、Slug、Twist等[9]。EMT的主要特征是上皮表型的缺失及间质特性的获得。上皮细胞的标记物包括E-cadherin、Claudin-1等，而间质的标记物有：N-cadherin、Vimentin、Fibronectin等[9]。

Oct4对ES及CSC均有维持其干细胞特性的作用[1,2]，研究还发现Oct4也参与肿瘤EMT过程的调控：Yin等[2]发现在肝癌细胞中Oct4可协同Nanog通过激活STAT3/Snail信号通路增强其迁移、侵袭及增殖的能力，EMT转录因子Twist、Snail及Slug蛋白表达升高，上皮标记物E-cadherin蛋白表达下调，而间质标记物N-cadherin 及Vimentin蛋白表达上调，诱导了EMT发生；Dai等[10]发现在CRC SW620细胞中沉默Oct4基因表达可减弱其迁移和侵袭能力，使E-cadherin蛋白表达上调，vimentin蛋白表达下调，发生了EMT逆转。人Oct4基因按所编蛋白N端差异把它分为3个主要的亚型Oct4A、Oct4B和Oct4B1，之前对Oct4的研究集中在Oct4A上，Oct4B1是最近才发现的Oct4的转录本， Papamichos等[11]认为Oct4B1在维持ES干细胞特性方面的作用比Oct4A更强。研究发现Oct4B1在胃癌、结直肠癌等恶性肿瘤中表达，具有抗肿瘤细胞凋亡的作用[4,5]。而Oct4B1是否在肿瘤细胞EMT过程中起调控作用，目前鲜见文献报道。

为了明确Oct4B1是否诱导结直肠癌细胞发生EMT，我们实施了下列实验：首先用带G418抗性的Oct4B1过表达质粒及阴性对照质粒转染结直肠癌SW480细胞，瞬时转染成功后，予G418筛选成功建立稳定转染的细胞株，用RT-qPCR检测发现实验组(稳定转染Oct4B1过表达质粒)Oct4B1的mRNA水平表达明显高于转染阴性对照质粒的对照组(P<0.01)(见图1B)，提示我们所建立的Oct4B1过表达稳定转染细胞株是成功的；接下来研究发现，划痕实验中实验组伤口愈合率明显高于对照组(P<0.01)(见图2)，Transwell小室实验中实验组细胞穿膜数显著高于对照组(P<0.01)(见图3)，提示过表达Oct4B1基因增强了SW480细胞迁移和侵袭能力；进一步研究发现，Western blot检测实验组上皮标记物E-cadherin蛋白表达明显低于对照组(P<0.01)，而间质标记物N-cadherin和Vimentin蛋白表达均明显高于对照组(P<0.01)(见图4)。以上实验结果表明过表达Oct4B1基因可诱导人结直肠癌SW480细胞发生EMT，细胞迁移和侵袭能力提高可能与EMT发生有关。我们进一步采用RT-qPCR及Western blot检测EMT转录因子Twist mRNA及蛋白的表达，结果实验组Twist的mRNA及蛋白水平均明显高于对照组(见图5、6)。提示过表达Oct4B1基因诱导SW480细胞发生EMT，其机制可能与提高Twist表达有关。

综上所述，我们的研究显示过表达Oct4B1基因可诱导人结直肠癌SW480细胞发生EMT，增强细胞迁移及侵袭能力，其分子机制可能与提高Twist表达有关。

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[收稿2016-11-03]

(编辑 倪 鹏)

Overexpression of Oct4B1 induces epithelial mesenchymal transition in colorectal cancer SW480 cells

CHENYi-Lin,WENKun-Ming,HUShui-Qing,CHENZheng-Quan,ZENGQing-Liang.

DepartmentofGastrointestinalSurgery,theAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563000,China

Objective:To investigate whether the overexpression of Oct4B1 gene induces epithelial mesenchymal transition in human colorectal cancer SW480 cells and its possible mechanism.Methods: Experimental group(SW480-Oct4B1)：Transfection of SW480 cell lines in colorectal cancer with Oct4B1 overexpression plasmid;Control group(SW480-Oct4B1):negative control plasmid with G418 resistance.Stably transfected cell lines were obtained by G418 culture medium.The two groups were compared with：①Detection of Oct4B1 gene expression in stably transfected cell lines by RT-qPCR；②Scratches and Transwell assays were used to estimate migration and invasion;③Detection of EMT related markers E-cadherin，N-cadherin and Vimentin protein expression by Western blot assay;④Detection of Twist gene and protein expression by RT-PCR and Western blot assays.Results: The transient transfection was confirmed by RT-qPCR and the stable transfected cell lines were obtained from two groups of cells transfected with G418 culture medium.Compared with the control group:①RT-qPCR revealed increased expression of Oct4B1 gene in the experimental group(P<0.01);②Cell migration and invasion were significantly increased(P<0.01);③Epithelial marker:the expression of E-cadherin protein was significantly decreased (P<0.01),interstitial marker:the expression of N-cadherin and Vimentin protein was significantly increased (P<0.01);④Twist mRNA and protein expression were significantly increased(P<0.01).Conclusion: Overexpression of Oct4B1 gene can induce epithelial mesenchymal transition in human colorectal cancer SW480 cells，its molecular mechanism may be related to the promotion of Twist expression.

Colorectal cancer cells;Oct4B1;Epithelial-mesenchymal transitions;Twist

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.004

①本文受国家自然科学基金(No.81260369)和贵州省科技厅科学技术基金[黔科合(J)字(2012)2365]资助。

陈奕霖(1988年-)，男，硕士，住院医师，主要从事大肠癌基础与临床方面研究，E-mail：254575402@qq.com。

及指导教师：文坤明(1978年-)，男，博士，教授，主要从事大肠癌基础与临床方面研究，E-mail：381224619@qq.com。

R735.3+5

A

1000-484X(2017)05-0656-05