天麻素抗心肌氧化应激损伤的作用机制研究*

郝帅林，张媛，魏艳杰，李朝阳，肖童，苏琦，苗雨欣，徐菁蔓，郝志梅，田炜

[1.华北理工大学 医学实验研究中心（国家科技部老年医学国际科技合作基地），河北 唐山 063000；2.华北理工大学 管理学院，河北 唐山 063000]

基础研究·论著

天麻素抗心肌氧化应激损伤的作用机制研究*

郝帅林1，张媛1，魏艳杰1，李朝阳1，肖童1，苏琦1，苗雨欣1，徐菁蔓1，郝志梅2，田炜1

[1.华北理工大学 医学实验研究中心（国家科技部老年医学国际科技合作基地），河北 唐山 063000；2.华北理工大学 管理学院，河北 唐山 063000]

目的探讨天麻素在大鼠心肌细胞氧化应激损伤时是否通过线粒体机制发挥心脏保护作用。方法首先使用过氧化氢H2O2650 μmol/L处理大鼠心脏组织来源的H9c2心肌细胞，复制氧化应激损伤模型。分别使用50.0、10.0、1.0和0.1 μmol/L天麻素预处理，利用共聚焦显微镜成像技术，检测线粒体膜电位的变化，四甲基偶氮唑盐比色法检测天麻素对细胞存活率的影响，Western blot检测天麻素对糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、蛋白激酶-B（Akt）活性的影响。结果不同浓度的天麻素预处理均能减弱H2O2引起的四甲基罗丹明乙酯荧光强度降低程度，且与模型组（0.30±0.25）比较，10.0 μmol/L天麻素预处理组（0.79±0.08）作用最为明显。天麻素（10.0μmol/L）预处理能提高H9c2细胞的存活率，使p-GSK-3β（Ser9）、p-Akt（Ser473）蛋白水平升高，而磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）抑制剂渥曼青霉素可以阻断其发挥作用。结论天麻素能够减轻由H2O2引发的H9c2心肌细胞氧化应激损伤，其可能是通过PI3K/Akt途径使GSK-3β失活，抑制mPTP开放以发挥心脏保护作用。

天麻素；线粒体通透性转换孔；氧化应激损伤；磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶-B

心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）是指在短时间心肌血供中断后，一定时间内恢复血供，原缺血心肌发生较血供恢复前更严重的损伤。目前普遍认为，在再灌注损伤发生、发展过程中，氧化应激是很重要的机制之一[1]。磷脂酰肌醇 -3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号途径是氧化应激过程中很重要的一条通路[2]。

天麻素是从兰科植物天麻的干燥茎块中提炼出含量最高的单体成份，具有抑制心肌细胞凋亡，增加心肌血供，调节血管舒缩功能的作用[3]。大量动物实验表明，天麻素在MIRI中能减少炎症因子、提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）含量、减轻Ca2+超载，说明天麻素在MIRI病理过程中具有一定的保护作用[4]，但是其具体保护机制尚不明确。因此，本研究采用过氧化氢H2O2650 μmol/L处理来源于大鼠胚胎心脏的H9c2心肌细胞，复制氧化应激损伤模型，探讨天麻素是否具有抗心肌缺血再灌注损伤作用，以及该保护作用是否是通过PI3K/Akt通路及线粒体保护机制实现的，以期为天麻素的临床应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株

大鼠胚胎心脏组织来源的H9c2细胞株购自美国ATCC公司。

1.2 试剂与仪器

实验药物天麻素由北京百威灵科技有限公司提供（纯度>99%），H2O2（批号STBB6350）购自美国Sigma公司，荧光染料四甲基罗丹明乙酯（Tetramethylrhodamine ethyl ester，TMRE）购自美国Invitrogen公司，渥曼青霉素（Wortmannin，Wort）购自北京索莱宝公司，兔源单克隆抗体p-Akt（Ser473）、p-GSK-3β（Ser9）及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗均购自美国Cell Signaling Technology公司，鼠源微管蛋白（Tubulin）多克隆抗体购自北京中杉金桥生物有限公司，改良Eagle培养基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）、四甲基偶氮唑盐比色法[3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]细胞增殖及毒性检测试剂盒、聚氰基丙烯酸正丁酯（Butyleyanoacrylate，BCA）蛋白浓度检测试剂盒、电化学发光免疫分析（electrogenerated chemiluminescence，ECL）发光检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术研究所，37℃二氧化碳CO2培养箱购自美国 Thermo Forma公司，FV 1000激光扫描共聚焦显微镜购自日本Olympus公司，生物安全柜购自新加坡ESCO公司，5804R高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司，JY200C电泳仪购自北京君意东方电泳设备有限公司，酶标仪和半干转运系统购自美国Bio-Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗细胞2遍，用5 ml含10%胎牛血清、双抗的DMEM完全培养基重悬H9c2细胞并转入50 ml培养瓶中，放置37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，培养24～48 h待细胞贴壁达培养瓶底壁面积>90%时，选生长状态良好的H9c2细胞用0.25%胰蛋白酶200 μl消化2 min，用10 ml培养基终止消化，反复轻轻吹打制成细胞悬液，传代2、3次/周。

1.3.2 实验分组及处理方法 实验共分为两部分。第一部分为天麻素抗心肌氧化应激损伤作用研究，分为：①对照组：正常心肌细胞不给予任何处理；②H2O2组：只加H2O2650 μmol/L处理20 min；③天麻素 +H2O2组：加入天麻素（50.0、10.0、1.0和0.1μmol/L）预处理20 min，加入H2O2650 μmol/L处理20 min。后面的研究中，天麻素+H2O2组均加入天麻素10 μmol/L预处理20 min后再加入H2O2650 μmol/L处理20 min；④天麻素组：只加天麻素10μmol/L处理20min。第二部分为天麻素抗心肌氧化应激损伤的机制研究，分为：①H2O2组：只加H2O2650μmol/L处理20min；②天麻素+H2O2组：加入天麻素 10 μmol/L预处理20 min，加入H2O2650 μmol/L处理20 min；③PI3K抑制剂（Wort）+天麻素+H2O2组：加入PI3K抑制剂100 nmol/L处理10 min，天麻素10 μmol/L处理20 min，H2O2650μmol/L处理20 min；④抑制剂（Wort）组：只加抑制剂 100 nmol/L处理10 min。

1.3.3 检测线粒体膜电位 将生长密度达80%～90%、状态良好的细胞置于超净工作台内，重复上述细胞培养步骤，胰酶消化后，用完全培养基悬浮后移到50ml离心管，在低速离心机上1000r/min离心5 min，弃上清液后用新的完全培养基重悬，混合均匀后传入共聚焦专用小皿，每个小皿2ml，培养24h，实验前弃去培养基，用PBS冲洗3次，然后用台式液2 ml（氯化钠140.0 mmol/L，氯化钾6.0 mmol/L，氯化镁1.0mmol/L，氯化钙1.0mmol/L，乙烷磺酸5.0mmol/L，葡萄糖5.8mmol/L，pH=7.4）于培养箱中继续培养2h。加入特异性荧光标记物TMRE 100 nmol/L，2μl孵育20 min，上镜观察，使用Delta T open Dish Systems特殊恒温装置使温度维持在37℃。激发光波长和发射光波长分别为543和560 nm。镜下观察不同时间红色荧光的变化，采集H2O2处理前及处理20 min后图像，并使用Image J软件对其荧光强度进行统计学分析。

1.3.4 MTT法检测细胞的存活率 选取对数生长期且细胞状态良好的细胞重复细胞培养步骤，待其消化、离心重新悬浮后进行细胞计数，稀释为1× 104个/ml，96孔板加入100 μl/孔，约1000个细胞，培养24～48 h，待其长到75%左右后按照各组要求处理，处理后把液体全部吸出，PBS冲洗，重新加入完全培养基100 μl，MTT溶液10 μl，在细胞培养箱内继续培养4 h后加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μl，15 min后显微镜下观察到蓝色结晶物完全溶解，用酶标仪在570 nm处测定每孔光密度值。计算细胞的存活率，细胞存活率（%）=实验组光密度（optical delnsity，OD）值/对照组OD值×100%。

1.3.5 Western blot检测p-Akt（Ser473）和p-GSK-3β（Ser9）蛋白表达 细胞培养48 h后弃培养基，PBS冲洗2遍，台式液孵育2 h，根据分组分别进行处理，PBS冲洗3次，加入40 μl裂解液冰上裂解30 min，收集细胞于Eppendorf管中，超声破碎15 s，4℃、12 000 r/min离心15 min后取上清液，使用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法进行蛋白定量。以50 μg/孔上样，进行电泳并转膜，使用10%脱脂奶粉室温摇床慢摇封闭2 h，孵育p-Akt（Ser473）和p-GSK-3β（Ser9）相对应的一抗（1∶1 000稀释），4℃摇床慢摇过夜（8～12 h），Tris-HCl缓冲盐溶液洗3次，10 min/次，加相应二抗（1∶1 000稀释）室温摇床慢摇2 h，Tris-HCl缓冲盐溶液洗3次，10 min/次，增强化学发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）荧光显色，用Image J进行灰度扫描及定量分析。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较用完全随机设计的单因素方差（One-way，ANOVA）分析，两两比较用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 天麻素对心肌细胞氧化应激损伤的影响

2.1.1 天麻素对心肌细胞线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）开放的影响 激光共聚焦显微镜结果显示，与对照组（0.92±0.07）比较，H2O2组处理后TMRE荧光强度（0.30±0.08）降低，提示650μmol/L H2O2可以使mPTP开放，引起线粒体损伤。而不同浓度（0.1、1.0、10.0和50.0μmol/L）天麻素预处理后的荧光强度值[分别为（0.40±0.13）、（0.66±0.15）、（0.79±0.08）和（0.51±0.07）]与H2O2组比较，可以不同程度地减弱H2O2引起的TMRE荧光强度降低程度，经方差分析，差异有统计学意义（F=26.062，P=0.000），说明天麻素能够减轻由650μmol/L H2O2引起的线粒体损伤，且天麻素浓度为10.0μmol/L时，该保护作用最为显著。见附表和图1。

2.1.2 天麻素对心肌细胞存活率的影响 MTT法测定心肌细胞的存活率结果显示，各组的OD值比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=45.844，P= 0.000）。H2O2组（0.56±0.05）与对照组（0.75±0.06）比较，差异有统计学意义（t=12.246，P=0.000），H2O2组心肌细胞的存活率下降。天麻素（10.0μmol/L）+ H2O2组（0.64±0.03）与H2O2组比较，差异有统计学意义（t=11.629，P=0.000），天麻素（10.0μmol/L）+ H2O2组心肌细胞的存活率较高。天麻素组（0.76± 0.06）与H2O2组比较，差异有统计学意义（t=13.659，P=0.000），天麻素组心肌细胞的存活率较高。表明天麻素具有抗心肌细胞氧化应激损伤保护作用。

附表 各组TMRE荧光强度比较 （±s）

附表 各组TMRE荧光强度比较 （±s）

注：t1、P1：与对照组比较；t2、P2：与H2O2组比较

组别 荧光强度比值t1值P1值t2值P2值对照组（n=9） 0.92±0.07 - - - -H2O2组（n=8） 0.30±0.08 11.635 0.000 - -天麻素（0.1μmol/L）+H2O2组（n=10） 0.40±0.13 2.339 0.021 3.316 0.000天麻素（1.0μmol/L）+H2O2组（n=10） 0.66±0.15 2.063 0.042 6.326 0.000天麻素（10.0μmol/L）+H2O2组（n=9） 0.79±0.08 2.936 0.004 12.276 0.000天麻素（50.0μmol/L）+H2O2组（n=8） 0.51±0.07 2.346 0.020 5.369 0.000

图1 不同浓度天麻素对TMRE荧光强度的影响 （×40）

2.1.3 天麻素对p-Akt（Ser473）蛋白表达的影响Western blot检测结果显示，p-Akt（Ser473）蛋白在对照组、H2O2组、天麻素+H2O2组表达为（100.0±14.1）、（45.0±10.2）和（69.0±8.2）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=4.630，P=0.022）。与对照组比较，H2O2组的 p-Akt（Ser473）表达下降（P<0.05），而天麻素（10.0μmol/L）预处理能够减轻H2O2降低Akt活性的作用（P<0.05）。提示Akt可能参与天麻素抗心肌细胞氧化应激损伤保护作用。见图2。

2.1.4 天麻素对p-GSK-3β（Ser9）蛋白表达的影响Western blot检测结果显示，p-GSK-3β（Ser9）蛋白在对照组、H2O2组、天麻素+H2O2组表达为（105.0± 12.4）、（47.0±8.1）和（73.0±11.2）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=6.326，P=0.000）。与对照组比较，H2O2组的p-GSK-3β（Ser9）表达降低（P<0.05）。相对于H2O2组，天麻素（10μmol/L）+H2O2组p-GSK-3β（Ser9）的表达增加（P<0.05）。提示天麻素可能通过提高GSK-3β的磷酸化水平来对抗由H2O2引起的心肌细胞线粒体损伤。见图3。

2.2 天麻素对PI3K/Akt信号转导通路的影响

图2 检测p-Akt（Ser473）的表达 （±s）

2.2.1 PI3K抑制剂对天麻素线粒体保护作用的影响 激光共聚焦结果显示，各组TMRE荧光强度比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=18.162，P= 0.000）。天麻素（10.0μmol/L）+H2O2组（0.79±0.08）与H2O2组（0.30±0.08）比较，差异有统计学意义（t=16.723，P=0.000），10.0μmol/L天麻素可以对抗H2O2引起的TMRE荧光强度降低，而发挥线粒体保护作用。PI3K抑制剂Wort+天麻素（10.0μmol/L）+H2O2组（0.33±0.20）与天麻素（10.0μmol/L）+H2O2组比较，差异有统计学意义（t=14.325，P=0.000）。Wort组与天麻素（10.0μmol/L）+H2O2组比较，差异有统计学意义（t=8.326，P=0.000），说明Wort可以阻断天麻素的保护作用，提示天麻素是通过PI3K/Akt信号转导通路发挥抗心肌细胞氧化应激损伤线粒体保护作用的。见图4。

2.2.2 Wort对p-Akt（Ser473）和p-GSK-3β（Ser9）表达的影响 Western blot检测结果显示，在H2O2组、天麻素 （10.0μmol/L）+H2O2组、Wort+天麻素（10.0μmol/L）+H2O2组、Wort组中，p-Akt（Ser473）蛋白表达分别为（55.0±9.1）、（101.0±10.1）、（46.0±3.2）和（56.00±7.2）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=9.316，P=0.000）。p-GSK-3β（Ser9）蛋白表达分别为（72.0±11.2）、（107.0±8.0）、（47.00±7.1）和（47.0± 10.1）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=12.337，P=0.011）。相对于H2O2组，天麻素（10μmol/L）+H2O2组的p-Akt（Ser473）和p-GSK-3β（Ser9）蛋白表达增强（P<0.05）；而与天麻素（10μmol/L）+H2O2组比较，加入PI3K抑制剂Wort后，p-Akt（Ser473）和p-GSK-3β（Ser9）蛋白表达均降低（P<0.05）。说明天麻素可能是通过PI3K/Akt通路调控GSK-3β活性，对H2O2引起的心肌细胞氧化应激损伤发挥保护作用。见图5。

图3 p-GSK-3β（Ser9）的表达 （±s）

图4 Wort对天麻素保护TMRE荧光强度作用的影响 （×40）

图5 Wort对天麻素升高p-Akt（Ser473）和p-GSK-3β（Ser9）的影响

3 讨论

天麻素作为名贵药材天麻的有效成分之一，具有抗炎、抗衰老、镇静等作用[5]。研究发现，天麻素在脑缺血再灌注损伤中能发挥抗炎、抗氧化的作用[6]，并且在同样具有复杂病理过程的心肌缺血再灌注损伤中也发挥着类似作用[7]。本研究中MTT结果显示，天麻素能增加心肌H9c2细胞的存活率，发挥抗氧化应激损伤保护作用。

mPTP的本质是心肌细胞线粒体膜上的一种跨膜多孔蛋白，在正常生理状态下，mPTP呈关闭状态。MIRI过程中，缺血、缺氧、氧化应激等机制可诱发mPTP开放，改变线粒体的通透性，导致细胞凋亡或者坏死，因此在MIRI过程中mPTP的开放成为诱导细胞死亡的重要机制[8]。实验研究证明腺苷[9]、红景天苷[10]等均通过阻止mPTP的开放抑制心肌细胞坏死而发挥心肌保护作用。本研究激光扫描共聚焦显微镜结果也表明，天麻素能够对抗H2O2引起的细胞线粒体膜电位降低，抑制氧化应激引起的mPTP开放，减轻心肌细胞线粒体的损伤，证明天麻素也通过线粒体机制发挥心肌保护作用。

GSK-3β是mPTP上游重要的调控因子，广泛分布于所有的真核细胞中，主要调节心脏糖原合成酶，GSK-3β失活会丧失对下游因子的调控能力，在MIRI过程中扮演重要角色[11]。黄芪甲苷[12]、白藜芦醇[13]等中药材就是通过上调p-GSK-3β的表达，抑制mPTP的开放，发挥抗氧化应激心肌保护作用。本研究结果显示，天麻素能够对抗H2O2作用，使p-GSK-3β（Ser9）的表达增加，说明天麻素可能是通过上调GSK-3β（Ser9）的磷酸化水平，从而抑制mPTP开放，发挥心肌保护作用。

PI3K属于信号转导蛋白质酶类的一个保守家族，主要调节细胞的增殖、分化、凋亡、生存，是下游信号分子Akt的首要调节点[14]。Akt作为信号通路的调节器，其活化后可以促进下游因子GSK-3β的磷酸化，同时PI3K/Akt作为体内重要的通路，在细胞活化、炎症反应、趋化性及凋亡等多种生物反应中扮演着重要角色[15-17]，在MIRI过程中有阻止mPTP开放、减少细胞凋亡的作用[18-19]。本研究结果也显示，天麻素可以对抗H2O2作用，使p-Akt（Ser473）的表达增加，当加入PI3K抑制剂Wort后，不但天麻素使p-Akt（Ser473）表达增加的作用消失，而且天麻素使p-GSK-3β（Ser9）表达增加，以及抑制mPTP开放的作用均被阻断，说明PI3K/Akt通路不但参与天麻素增加p-GSK-3β（Ser9）表达，抑制mPTP开放的抗氧化应激心肌保护作用，而且还是该作用的重要调控因素。

综上所述，天麻素预处理可以通过减轻H2O2引起的H9c2心肌细胞线粒体损伤，发挥抗氧化应激损伤保护作用，该作用可能是通过PI3K/Akt途径使GSK-3β失活，进而抑制mPTP开放来实现的。

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（童颖丹 编辑）

Protective effect of gastrodin against myocardial oxidative stress damage*

Shuai-lin Hao1,Yuan Zhang1,Yan-jie Wei1,Zhao-yang Li1,Tong Xiao1, Qi Su1,Yu-xin Miao1,Jing-man Xu1,Zhi-mei Hao2,Wei Tian1
[1.Medical Experimental Research Center(International Science and Technology Cooperation Base of Geriatric Medicine),North China University of Science and Technology,Tangshan, Hebei 063000,China;2.College of Management,North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063000,China]

ObjectiveTo investigate whether gastrodin plays a protective role in rat myocardial cell oxidative stress by mitochondrial pathway.MethodsH2O2(650 μmol/L)was used to induce oxidative stress injury of H9c2 cells,and the pretreatment concentration of gastrodin was 50.0,10.0,1.0 and 0.1 μmol/L respectively. Laser scanning confocal microscopy(LSCM)was used to detect mitochondrial membrane potential.MTT method was used to test the effect of gastrodin on cell survival rate.Western blot was used to observe the influences of gastrodin on the activity of glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β)and protein kinase B (Akt).ResultsPretreatment of gastrodin with different concentrations could prevent the reduction of fluorescence intensity of tetramethylrhodamine ethyl ester caused by H2O2,and the 10.0 μmol/L gastrodin pretreatment group had the most obvious effect compared with the model group[(0.79±0.08)vs(0.30±0.25)].Pretreatment with gastrodin(10.0 μmol/L)improved the survival rate of H9c2 cells(P<0.05)and increased protein expressions of p-GSK-3β (Ser9)and p-Akt (Ser473);whereas PI3K inhibitor,Wortmannin penicillin (Wort),could block this effect.ConclusionsGastrodin can alleviate oxidative stress damage of H9c2 myocardial cells caused by H2O2.It may inactivate GSK-3β through PI3K/Akt pathway,thereby play a cardiac-protective role through inhibition of mPTP opening.

gastrodin;mitochondrial permeability transition pore;oxidative stress injury;phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B(Akt)

R285.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.09.001

1005-8982（2017）09-0001-07

2016-07-05

河北省自然科学基金（No：H2012401036）；河北省高等学校科学技术研究项目（No：QN20131072）；华北理工大学大学生创新项目（No：X2016214）

田炜，E-mail：twhzm@aliyun.com；Tel：13513451200