硫化氢减轻糖尿病小鼠胰岛素抵抗的作用机制研究

孙耀，贾云宏

（锦州医科大学 药学院，辽宁 锦州 121000）

硫化氢减轻糖尿病小鼠胰岛素抵抗的作用机制研究

孙耀，贾云宏

（锦州医科大学 药学院，辽宁 锦州 121000）

目的探究硫化氢（H2S）对糖尿病小鼠胰岛素抵抗的作用和可能的分子机制。方法C57Bl/6J小鼠随机分为正常对照组、糖尿病组、低剂量治疗组、高剂量治疗组及阳性对照组，四氧嘧啶联合高脂饮食复制糖尿病小鼠模型，检测各组小鼠脂肪组织中Caspase-3的活性、B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl2）、Bcl-2相关X（Bax）蛋白的表达水平，以及空腹血糖、空腹血清胰岛素和血浆H2S浓度，并计算胰岛素敏感指数。结果糖尿病小鼠Caspase-3活性和Bax表达水平下调，而Bcl2蛋白表达水平上调，治疗组各指标得到缓解。结论H2S可以减轻胰岛素抵抗，其机制可能为减轻脂肪组织的细胞凋亡。

硫化氢；糖尿病；胰岛素抵抗；脂肪组织；凋亡

硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）是继一氧化氮NO后发现的又一重要气体信号分子，在疾病发生、发展中起重要作用。硫氢化钠（sodium hydrosulfide，NaHS）口服给药进入体内后，可以在各组织释放出H2S，该作用已经广泛应用于科学研究。近年来糖尿病发病率不断升高，调查显示我国成人糖尿病的患病率达9.7%，更为严重的是处于糖尿病前期的比例达15.5%[1]。糖尿病的研究和治疗已成为当务之急。有研究认为，H2S可以缓解多种细胞的凋亡[2]。也有研究认为，脂肪组织细胞的凋亡和胰岛素抵抗相关，Caspase 3是与细胞凋亡相关的重要蛋白分子，而其作用可以被B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl2）和BCL-2相关X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）形成的异源二聚体阻断[3]。本实验检测正常小鼠、糖尿病小鼠及各治疗组小鼠的胰岛素抵抗情况、反映脂肪组织细胞凋亡的Caspase-3活性，以及Bcl2和Bax的表达量，进而探究糖尿病小鼠胰岛素抵抗与脂肪组织细胞凋亡的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

无特定病原体（specefic pathogen free，SPF）级4周龄C57BL/6J小鼠75只[北京华阜康公司，编号：SCXK（京）2009-0015]，体重（12±1）g，均为雄性，随机分为正常对照组（NC组）（8只）和模型组（67只）。自由饮水、摄食，动物房内12 h昼夜循环，室温（22± 2）℃。四氧嘧啶（美国SIGMA公司，120 mg/kg，2次腹腔注射）复制糖尿病小鼠模型，专用高能量饲料（10%蔗糖、10%脂肪）（北京华阜康公司）用于模型组小鼠喂养，小鼠全价营养颗粒基础饲料（北京华阜康公司）用于正常C57BL/6J小鼠喂养。入组的糖尿病小鼠连续2次随机血糖≥13.9 mmol/L。将复制成功的39只小鼠分为糖尿病组（DM组）（12只）、低剂量治疗组（LT组）（9只）、高剂量治疗组（HT组）（9只）及阳性对照组（PC组）（9只）。对照组和糖尿病组自由饮取无菌水，低剂量治疗组和高剂量治疗组分别饮用0.003和0.009 g/L NaHS无菌水溶液，阳性对照组小鼠给予吡格列酮1.95 mg/kg灌胃，自由饮取无菌水。8周后，糖尿病小鼠死亡3只，低剂量治疗组和阳性对照组小鼠各死亡1只，将糖尿病组小鼠和高剂量治疗组小鼠各随机剔除1只，其余用于实验。所有动物实验过程按照锦州医科大学伦理委员会规定进行。

1.2 生化指标检测

用药8周后，各组小鼠禁食6 h，断头取血，留取血清测定空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG），用放射免疫分析（radio immunoprecipitation assay，RIPA）法测定空腹血清胰岛素（fasting serum insulin，FINS），根据公式计算胰岛素敏感指数（insulin sen sitive index，ISI），ISI=1/（FPG×FINS），取自然对数正态化后进行分析。

1.3 血浆硫化氢浓度测定

新鲜血分离血浆，立即采用1.5 ml离心管储存，封口膜封存以防止硫化氢损失，100 μl血浆和350 μl磷酸盐缓冲溶液（pH=7.4）加入200 μl 1%无水醋酸锌，立即封存。将20 mmol N，N二甲基硫酸盐（7.2 mol/L，133 μl）和30 mmol Fecl3（1.2 mol/L，133μl）的盐酸溶液混合，37℃孵育45 min，三氯乙酸溶液（10%W/V，250 μl）终止反应，离心5 min，取200 μl上清液移入96孔板，测670 nm处吸光度值，根据已知浓度的NaHS（0.01～100.00 μmol/l）做标准曲线，计算硫化氢浓度。

1.4 Caspase-3活性检测

1.4.1 组织总蛋白提取及定量 用药8周后处死小鼠，速取部分腹腔脂肪组织，置入-80℃冰箱冷冻保存备用。取少量小鼠脂肪组织剪碎后加细胞裂解液[RIPA∶蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）为100∶1，体积约为组织体积的5倍]，匀浆机匀浆30 s，12 000 r/min离心10min，取中层液体，聚氰基丙烯酸正丁酯蛋白定量试剂盒（北京博奥森公司）测总浓度，并调整各蛋白浓度2 mg/ml，置入-80℃冰箱保存备用。

1.4.2 Caspase-3活性检测 Caspase-3分光光度法检测试剂盒（沈阳万类公司）检测Caspase-3活性，结果以试剂盒中相同吸光度值的标准品浓度表示。1.5 Western blot检测

1.5.1 取材及蛋白定量 取材及蛋白定量同1.4.1，取备用样本、6×上样缓冲液，三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST）调整蛋白浓度均为2 mg/ml，95℃水浴5 min，置入-80℃冷冻保存备用。

1.5.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 12%分离胶和5%浓缩胶，20μl/孔的样本及小分子Maker（上海赛默飞公司）上样进行电泳，1×上样缓冲液防止边缘效应。采用湿转法转蛋白至聚偏氟乙烯膜，Bcl2和Bax多克隆抗体（北京博奥森公司）4℃过夜，过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗孵育2 h。用GISt 020凝胶图像分析仪及成像。

1.6 实时荧光定量聚合酶链反应

Trizol提取总 mRNA，Nandrop 2000检测总mRNA量，RNeasy Plus Mini试剂盒（大连TaKaRa生物科技公司）将mRNA反转录为cDNA，QIAGEN Fast Cycling聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（日本TaKaRa公司）。PCR反应条件：95℃预变性10 s，95℃变性5 s，60℃退火15 s，70℃延伸15 s，共45个循环。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成，Bcl2正向引物：5'-CCCCTCGCATCTTCTCCTTCC-3'，反向引物：5'-C CACCACCTCCTTGAGAAGTCC-3'；Bax正向引物：5'-CCAGGATGCGTCCACCAA-3'，反向引物：5'-CAC CAACGGGAGAAGATGAAACG-3'；甘油醛-3-磷酸脱氢酶正向引物：5'-TTGTCAAGCTCATTTCCTGGTA TG-3'，反向引物：5'-GGATAGGGCCTCTCTTGCTCA-3'，所得数据以甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为参照，计算Bax和Bcl2基因的相对拷贝数，相对拷贝数用2-△△ct表示。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用方差分析，两两比较用LSD-t法，Bax mRNA/Bcl2 mRNA比值部分资料，方差不齐，采用Tamhane’s T2法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生化指标

各组小鼠FPG、FINS、ISI比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=21.923、75.311和55.873，P=0.000）。糖尿病组小鼠FPG、FINS及ISI与正常对照组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（P< 0.05），糖尿病组小鼠FINS较高，而ISI较低；低剂量治疗组、高剂量治疗组小鼠FPG、FINS及ISI与糖尿病组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（P< 0.05），低剂量治疗组和高剂量治疗组小鼠各指标得到改善。高剂量治疗组小鼠FPG、FINS及ISI与低剂量治疗组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1～3。

2.2 血浆硫化氢浓度

各组小鼠血浆硫化氢浓度比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=48.506，P=0.000）。糖尿病组血浆硫化氢浓度与正常对照组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（P<0.05），糖尿病组血浆硫化氢浓度较低；低剂量治疗组、高剂量治疗组血浆硫化氢浓度与糖尿病组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（P<0.05），低剂量治疗组、高剂量治疗组血浆硫化氢浓度较高；高剂量治疗组小血浆硫化氢浓度与低剂量治疗组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（P<0.05），高剂量治疗组小鼠血浆硫化氢浓度高于低剂量治疗组。见图4。

2.3 Caspase-3活性

图3 各组小鼠ISI水平 （±s）

图4 各组小鼠血浆硫化氢浓度 （±s）

各组小鼠脂肪组织Caspase-3活性比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=221.887，P= 0.000）。糖尿病组小鼠脂肪组织Caspase-3活性与正常对照组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（P<0.05），糖尿病组小鼠脂肪组织Caspase-3活性较高；低剂量治疗组小鼠Caspase-3活性与糖尿病组小鼠比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（P< 0.05），Caspase-3活性有所降低；高剂量治疗组小鼠Caspase-3活性与低剂量治疗组小鼠比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（P<0.05），Caspase-3活性进一步降低。见图5。

图5 各组小鼠脂肪组织Caspase-3活性 （±s）

2.4 Bax、Bcl2蛋白表达水平变化

各组小鼠Bax、Bcl2蛋白表达水平及Bax/Bcl2比值比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F= 34.711、11.658和18.232，P=0.000、0.001和0.000）。糖尿病组小鼠脂肪组织Bax蛋白表达水平与正常对照组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（P< 0.05），糖尿病组小鼠脂肪组织Bax蛋白表达增加；糖尿病组小鼠Bcl2蛋白表达水平与正常对照组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（P<0.05），糖尿病组小鼠Bcl2蛋白表达水平降低；糖尿病组小鼠Bax/Bcl2比值与正常对照组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（P<0.05），糖尿病组小鼠Bax/Bcl2比值升高；低剂量治疗组糖尿病小鼠脂肪组织Bax蛋白与高剂量治疗组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（P<0.05），糖尿病小鼠脂肪组织Bax蛋白表达降低，而低剂量治疗组小鼠Bcl2蛋白与高剂量治疗组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（P<0.05），低剂量治疗组小鼠Bcl2表达增加；低剂量治疗组小鼠Bax/Bcl2比值与高剂量治疗组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（P<0.05），低剂量治疗组小鼠Bax/Bcl2比值降低；高剂量治疗组小鼠Bax/Bcl2比值与低剂量治疗组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（P<0.05），高剂量治疗组小鼠Bax/Bcl2比值低于低剂量治疗组。见图6～9。

图6 Western blot检测各组小鼠脂肪组织Bax、Bcl2蛋白表达

图7 各组小鼠脂肪组织Bax蛋白相对表达量 （±s）

图8 各组小鼠脂肪组织Bcl2蛋白相对表达量 （±s）

图9 各组小鼠脂肪组织Bax/Bcl2蛋白比值 （±s）

图10 各组小鼠脂肪组织Bax mRNA相对表达量 （±s）

2.5 Bax、Bcl2 mRNA表达水平变化

各组小鼠Bax mRNA、Bcl2 mRNA及Bax mRNA/ Bcl2 mRNA比值比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=164705.306、303 239.562和20 008.636，P=0.000）。两两比较用LSD法或Tamhane’s T2法，结果表明，糖尿病组小鼠脂肪组织Bax mRNA、Bcl2 mRNA表达水平与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），糖尿病组小鼠脂肪组织Bax mRNA表达增加，Bcl2 mRNA表达水平降低；糖尿病组小鼠脂肪组织Bax mRNA/Bcl2 mRNA比值与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），糖尿病组小鼠脂肪组织Bax mRNA/Bcl2 mRNA比值较高；低剂量治疗组、高剂量治疗组小鼠Bax mRNA、Bcl2 mRNA及Bax mRNA/Bcl2 mRNA比值与糖尿病组比较，差异有统计学意义（P<0.05），低剂量治疗组和高剂量治疗组脂肪组织Bax mRNA表达降低，Bcl2 mRNA表达增加，Bax mRNA/Bcl2 mRNA比值降低；高剂量治疗组Bax mRNA/Bcl2 mRNA比值与低剂量治疗组比较，差异有统计学意义（P<0.05），高剂量治疗组Bax mRNA/Bcl2 mRNA比值低于低剂量治疗组。见图10～12。

图11 各组小鼠脂肪组织Bcl2 mRNA相对表达量（±s）

图12 各组小鼠脂肪组织Bax mRNA/Bcl2 mRNA比值（±s）

3 讨论

糖尿病胰岛素抵抗是糖尿病治疗的重要难题之一。有报道显示，糖尿病患病率高达9.7%，而糖尿病前期更是高达15.5%[1]。无论是糖尿病患者，还是糖尿病前期患者，普遍存在胰岛素抵抗，严重影响患者的治疗和预后，硫化氢近年来被证实是一种新型气体信号分子，参与机体内许多生理功能的调控[4]。JIAN等[5]首次报道，2型糖尿病患者血浆H2S水平比正常人降低。有研究证实，硫化氢与肥胖小鼠胰岛素抵抗相关[6]。笔者猜想外源性补充硫化氢可能减轻糖尿病小鼠的胰岛素抵抗。NaHS作为一种常见的硫化氢供体已广泛用于科学研究，故低剂量治疗组和高剂量治疗组采用NaHS作为硫化氢供体，用于糖尿病小鼠的治疗，同时使用能提高胰岛素敏感性的吡格列酮用于阳性对照组小鼠治疗。本实验结果显示，NaHS在实验中达到相应稳定的硫化氢血药浓度。本实验检测糖尿病小鼠血糖和FINS发现，与正常对照组小鼠相比，糖尿病组小鼠FPG和FINS升高，ISI下降，在硫化氢治疗后，FPG和FINS下降，ISI升高。说明外源性补充硫化氢可以减轻糖尿病小鼠胰岛素抵抗。硫化氢也被报道其在心脏和肾脏缺血再灌注模型中具有明显的抗凋亡生物学效应[7]。目前，发现外源性补充H2S的供体NaHS可以明显改善心肌细胞凋亡[8-9]。然而糖尿病小鼠脂肪组织中是否有明显的细胞凋亡，以及外源性补充硫化氢是否可以缓解脂肪组织的凋亡还没有相关报道。

Caspase家族在凋亡过程中起重要作用，当Caspase家族基因层层激活后，最终导致细胞凋亡，Caspase-3在Caspase家族中处于关键位置，因此Caspase-3常作为凋亡发生的标志酶。笔者检测小鼠脂肪组织中Caspase-3的活性，结果发现，与正常对照组小鼠相比，糖尿病小鼠脂肪组织Caspase-3活性增加，而在硫化氢治疗后，其活性降低且存在剂量依赖性[10]。这提示硫化氢减轻糖尿病小鼠胰岛素抵抗可能与减轻脂肪组织的细胞凋亡有关。

胰岛素抵抗Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡中的作用分为两类：①以Bcl-2为代表的抗凋亡蛋白；②以Bax为代表的促凋亡蛋白。Bcl-2和Bax可以形成异源二聚体，阻断细胞色素C的释放，继而抑制Caspase-3蛋白的活化，有效抑制细胞凋亡[11]。当Bcl-2/ Bax比值增高时，提示抑制细胞凋亡的作用增强；反之，提示促进细胞凋亡作用增强，因此Bax/Bcl-2蛋白比值决定细胞的生存和死亡[12-13]。为进一步确认糖尿病小鼠脂肪组织细胞凋亡增加，而在硫化氢治疗后减少，笔者采用Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应检测小鼠脂肪组织Bcl2、Bax蛋白及mRNA的表达量。笔者发现和对照组相比，糖尿病组小鼠脂肪组织的Bax和Bcl2表达增加，在硫化氢治疗后减少。该结果进一步确认笔者的发现，与治疗组相比，糖尿病小鼠脂肪组织细胞凋亡增加，硫化氢治疗后凋亡减少。

综上所述，硫化氢减轻糖尿病小鼠胰岛素抵抗，这可能与其缓解脂肪组织的细胞凋亡有关。但是该结果有待进一步利用基因沉默和过表达等方法调节Bax和/或Bcl2的表达来进一步研究。

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（童颖丹 编辑）

Hydrogen sulfide alleviates insulin resistance by reducing apoptosis of adipose cells in diabetic mice

Yao Sun,Yun-hong Jia
(College of Pharmacy,Jinzhou Medical University,Jinzhou,Liaoning 121000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of hydrogen sulfide on insulin resistance and its mechanism in mice with diabetes mellitus.MethodsC57Bl6/J mice were randomly divided into normal control group,diabetes mellitus group,low-dose therapy group,high-dose therapy group and positive control group.Diabetes mellitus models were established by high-fat diet and tetraoxypyrimidine.Caspase-3 activity,Bcl-2 and Bax expressions in adipose tissue were measured,as well as fasting plasma glucose,fasting serum insulin and hydrogen sulfide in plasma.Then,insulin sensitivity index was calculated.ResultsCaspase-3 activity and Bax level were down-regulated,while Bcl2 was up-regulated in mice with diabetes mellitus,and all the indexes recovered after therapy with sodium hydrosulfide.ConclusionsHydrogen sulfide could alleviate insulin resistance by reducing the apoptosis of adipose cells.

hydrogen sulfide;diabetes mellitus;insulin resistance;adipose tissue;apoptosis

R587.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.09.003

1005-8982（2017）09-0013-06

2016-08-18

贾云宏，E-mail：Jiayunhong2012@163.com；Tel：18104068238