红景天内生真菌发酵产物对肺癌细胞Huh7生长抑制情况的研究

李燕++邓倩++李小清++马洪鑫++李彦斌++刘俊林

摘 要：目的 初步研究红景天内生真菌不同菌株发酵产物对肺癌细胞（Huh7）生长的抑制情况，筛选出其发酵产物对肺癌细胞（Huh7）的生长有较大抑制作用而对BHK细胞生长有较小抑制作用的红景天内生真菌菌株并且得到其抑制率。方法 采用液体发酵法、萃取法、冷冻真空干燥法提取红景天内生真菌发酵产物，采用MTT法研究红景天内生真菌发酵产物对肺癌细胞、BHK细胞生长的抑制效果。结果 实验初步找到4株红景天内生真菌其发酵产物对肺癌细胞生长的抑制率达到或超过50%，3株红景天内生真菌其发酵产物对BHK细胞生长的抑制率不超过10%。结论 红景天内生真菌发酵产物对肺癌细胞有抑制作用，有待于我们更多次的实验来验证此结论，在验证过程中需要做到更加规范的实验操作以及避免实验过程中造成的污染问题。

关键词：红景天 内生真菌 肺癌细胞 BHK细胞 MTT

中图分类号：R28 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2017）02（b）-0249-02

肺癌是一种常见的癌症，肺癌一般指的是肺脏实质部分的癌变，根据全国肿瘤登记中心2014发布的数据，我们可以知道我国肺癌死亡人数达到48.66万[1]， 2012年，美国新增肺癌患者22.6万左右，因为肺癌死亡人数为16.0万左右，调查显示，肺癌也将成为我国肿瘤死亡主要原因之一[2]。目前治疗肺癌的医疗方法依然是通过外科手术切除早期肺癌肿瘤，通过放疗、化疗等手段进行治疗也是重要手段，但是放疗、化疗、外科手术对患者造成的不良反应非常大，寻找新型的治疗肺癌的天然药物显得非常重要。虽然现在已经有许多关于肺癌治疗的天然药物、特效药物的研发报道，但是没有哪一种药物是非常有效且无不良反应的。对治疗肺癌的新型天然药物的探索依然有许多困难亟待人们去解决。

红景天是景天科多年生草本植物，红景天具有抗氧化、抗疲劳、抗缺氧、抗辐射的功效，中医里红景天被用来治疗多种疾病[1]。近年来的研究证明，红景天的有效成分具有保护心脑血管系统、调节免疫功能、治疗肿瘤等作用[3]。该研究初步研究红景天内生真菌菌株发酵产物对肺癌细胞（Huh7）增殖的抑制情况，以期为今后相关的研究提供一定参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）红景天内生真菌菌株：西北民族大学生命科学与工程学院生物与制药实验室保藏。

（2）癌细胞（Huh7）：西北民族大学实验中心保藏细胞。

（3）试剂：琼脂：天津市光复精细化工研究所；乙酸乙酯：烟台市双双化工有限公司；葡萄糖：天津市北辰方正试剂厂；胰酶：取自中国农业科学院兰州兽医研究所；细胞培养液：取自中国农业科学院兰州兽医研究所；胎牛血清：杭州四季清生物制品公司；MTT：Solarbio DMSO：VETEV。

1.2 方法

1.2.1 液体PDA培养基制作

新鲜去皮马铃薯200 g，切碎，加蒸馏水煮沸30 min，然后用8层纱布过滤两遍，留下过滤液备用，往过滤液里加入葡萄糖20 g，再用蒸馏水定容至1 000 mL，最后高温高压蒸汽灭菌30 min，冷却待用[2]。

1.2.2 内生真菌发酵产物提取

将活化的真菌菌株接种到PDA液体培养基中，于恒温摇床上150 r/min，28 ℃发酵7～14 d，终止发酵。用8层纱布过濾发酵物，发酵液用乙酸乙酯萃取3次，混合提取液，冷冻真空干燥后得到发酵产物[3-6]。

1.2.3 细胞培养与MTT测试

细胞传代培养时用胰酶消化一定时间，加入培养液吹打混匀细胞，培养BHK细胞的培养液中加入新生牛血清10%，培养肺癌细胞的培养液中加入10%的胎牛血清，于CO2恒温培养箱培养，培养24 h观察1次。将浓度为1.0×104个/ mL细胞悬液，用微量加样器接种到96孔细胞培养板，每孔200 ?L，接种24孔，置CO2培养箱培养。从培养第24 h开始，每24 h分别于超净工作台上吸出3孔的细胞进行计数，计算其平均值。以细胞浓度为纵坐标、细胞生长时间为横坐标绘制生长曲线。

将红景天不同菌株的发酵产物用细胞培养液配置成浓度为5 ug/mL的实验组液待用。取对数生长期细胞，消化后，以1×105细胞密度加入96孔板中，每孔100 uL，培养10 h后，分别加入实验组用液100 uL，对照组加等量培养液，每组设置3个复孔，培养48 h后每孔加5 mg/mL的MTT 20 uL，继续培养4 h，弃上清，加入200 uL的DMSO，轻轻震荡，用酶标仪在570 nm波长处测每孔OD值，计算平均值，并且按以下公式计算抑制率：抑制率=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值×100%[5-10]结果取整数。

实验将得到的12株真菌菌株的发酵产物都对肺癌细胞进行MTT实验，筛选出对肺癌细胞有较大抑制作用的真菌菌株，再将这些真菌菌株的发酵产物对BHK细胞进行MTT实验，筛选出对肺癌细胞有较大抑制作用而对BHK细胞生长抑制作用较小的红景天内生真菌菌株。

2 结果与分析

由表1可知：菌株HJT-16-3、HJT-16-14、HJT-16-17、HJT-16-23的发酵产物对Huh7细胞的抑制活性均达到和超过50%；其余11株菌株的发酵产物对Huh7细胞都显示有抑制作用，但是其抑制率不超过5%，笔者认为这可能是在加入测试药液后因为培养液成分的突然改变引起细胞死亡，并不是因为药液对细胞的生长有抑制作用；菌株HJT-16-8、HJT-16-17、HJT-16-32的发酵产物对BHK细胞的抑制作用小，不超过10%，其余菌株发酵产物对BHK细胞的抑制率较大，在68%～84%之间；所有菌株中，HJT-16-17对肺癌细胞（Huh7）的抑制率为75%，而对BHK细胞的抑制率仅为9%，为该研究所要寻找的目标菌株。

3 讨论

肺癌严重影响人类生存质量，当今治疗肺癌的有效方法依然是外科手术切除或者化学治疗、物理放射治疗，这些治疗方法都会对机体产生不良反应，而且不一定能够治愈。目前，寻找治疗癌症的靶向药物和天然新型药物为研究的热点。该研究采用液体发酵、液相萃取、冷冻真空干燥、MTT实验方法初步研究红景天内生真菌发酵产物对肺癌细胞生长的影响情况并且筛选出能够发酵产生对肺癌细胞生长有较好抑制作用的物质的菌株，研究的目的是为了寻找对肺癌细胞有抑制作用的药用物质，同时考虑到药用物质应该对正常细胞无较大危害，所以该研究同时选取BHK细胞为代表，测试了发酵产物对正常BHK细胞生长的影响。该研究找到一株符合研究目标的菌株HJT-16-17，其发酵产物对肺癌细胞（Huh7）的抑制率为75%，而对BHK细胞的抑制率为9%。

该研究所用的红景天内生真菌保藏菌株是还没有进行过分子鉴定的菌株，而且该研究没有对所得到的发酵产物进行成分和结构分析，没有对所得到的发酵产物抑制Huh7增殖的机制进行研究，这些问题将在接下来的研究中去完成。

参考文献

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