黑皮鸡枞菌固体培养基的优化

徐兵，张玉琴，冀宏

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500）

黑皮鸡枞菌固体培养基的优化

徐兵，张玉琴，冀宏*

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500）

以黑皮鸡枞菌菌丝日生长速率为指标，首先通过单因素试验确定最佳的碳源、最佳碳源的最优量、最佳氮源、最佳氮源的最优量，然后经过响应面试验的优化，得出最佳固体培养基配方：琼脂20 g/L，果糖23 g/L，胰蛋白胨3 g/L，VB12mg/L，自然pH的条件下，通过验证培养后，黑皮鸡枞菌丝生长速率达到0.9cm/d。

黑皮鸡枞菌；固体培养基；单因素；响应面法

黑皮鸡枞菌（Termitomyces albuminosus）是属担子亚门菌，层菌纲，伞菌目，口蘑科[1-4]。其肉质鲜嫩，口感独特，作为食品药品皆可，备受人们青睐。黑皮鸡枞菌是相关科研人员经过数年的潜心研究，在2006年选育出能实现人工栽培的珍稀食用菌，其中胡尚勤[5]、曾先福[6]等对鸡枞菌的生长条件有一定的研究。虽然对于黑皮鸡枞菌人工栽培技术有小规模的成果[7]，但对于黑皮鸡枞菌固体培养基优化还鲜见报道，所以本试验对黑皮鸡枞固体培养基进行优化，试验数据为生产提供了一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 原料和设备

黑皮鸡枞：常熟理工学院食用菌发酵工程技术研究中心种植。

303A-3S型电热恒温干燥培养箱：浦东荣丰科学仪器厂；GZX-GF101-AO-S型电热鼓风干燥箱：南京百思威科技有限公司；LDZX-75KBS（内循环）型立式压力蒸汽灭菌器、M124A型电子天平：南京菲奇工贸有限公司；SW-CJ-2F型洁净工作台：苏州净化公司；ZQWY-200G型震荡培养箱：上海知楚仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基配方

母种培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，琼脂20 g，pH自然。

基本培养基：葡萄糖20 g，酵母粉2 g，水1 000 mL，0.003 g，琼脂20 g，pH自然。

1.2.2 固体培养

先对黑皮鸡枞进行组织分离，做成母种，再将母种接种到基本培养基，在恒温恒湿培养箱中培养，用卡尺测量菌落直径，单位为mm。分别从每个配方中选择长势较好的培养皿，每个菌落用十字交叉法垂直测量直径各1次，取其平均值。纯生长量=菌落平均直径-原培养基直径，所以，黑皮鸡枞菌菌丝日生长速率=纯生长量/天数[8-11]。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 碳源的影响

以菌丝的日生长速率为指标，研究配方中不同碳源对黑皮鸡枞菌菌丝生长速率的影响。碳源设为：葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉[12]。碳源的含量为20 g/L，酵母粉的含量为3 g/L，VB1的含量为3 mg/L，琼脂20 g，1 000 mL水。

1.2.3.2 碳源含量的影响

以菌丝的日生长速率为指标，研究配方中碳源的不同含量对黑皮鸡枞菌菌丝生长速率的影响。碳源的含量设为：10、15、20、25、30 g/L。酵母粉的含量为3 g/L，VB1的含量为3 mg/L，琼脂20 g，1 000 mL水。

1.2.3.3 氮源的影响

以菌丝的日生长速率为指标，研究配方中不同氮源对黑皮鸡枞菌菌丝生长速率的影响。氮源设为：蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、玉米粉、豆粕粉[13]。碳源的含量为20 g/L，氮源的含量为3 g/L，VB1的含量为3 mg/L，琼脂20 g，1 000 mL水。

1.2.3.4 氮源含量的影响

以菌丝的日生长速率为指标，研究配方中氮源的不同含量对黑皮鸡枞菌菌丝生长速率的影响。氮源的含量设为：1、2、3、4、5 g/L。碳源的含量为20 g/L，VB1的含量为3 mg/L，琼脂20 g，1 000 mL水。

1.2.4 响应面试验设计

碳源、氮源是影响黑皮鸡枞固体培养的关键因素，微量元素对于菌丝体生长也是有一定帮助的，虽然微量，但是可以促进菌丝体生长。所以，本试验将添加VB1的含量作为响应面研究的一个因素探讨黑皮鸡枞菌的最适固体培养基，采用Box-Behnken模型进行设计，采用Design Expert 8.05 b软件进行数据处理。编码与因子的实际浓度的对应关系见表1。

表1 编码与因子的实际浓度的对应关系Table 1The corresponding relation between encode and factor practical concentration

2 结果与分析

2.1 固体培养条件优化单因素试验

2.1.1 碳源的影响

不同碳源的黑皮鸡枞菌菌丝日生长速率见图1。

图1 不同碳源的黑皮鸡枞菌菌丝日生长速率Fig.1Mycelium growth rate of Termitomyces albuminosus from different glucose

由图1可知，当固体培养基碳源是果糖的时候，黑皮鸡枞菌丝日生长速率最大，是0.91 cm/d，其次是葡萄糖和蔗糖。因此，选择果糖作为最佳碳源。

2.1.2 碳源含量的影响

果糖不同含量的黑皮鸡枞菌菌丝日生长速率见图2。

图2 果糖不同含量的黑皮鸡枞菌菌丝日生长速率Fig.2Mycelium growth rate of Termitomyces albuminosus from different amount of fructose

由图2可知，黑皮鸡枞菌丝日生长速率随果糖的增加而升高，但当果糖含量达30 g/L后，黑皮鸡枞菌丝日生长速率急速下降，因此，优选出3个果糖最佳含量：25、20、15 g/L。

2.1.3 氮源的影响

不同氮源的黑皮鸡枞菌菌丝日生长速率见图3。

由图3可知，氮源的选择对黑皮鸡枞菌菌丝生长速率也有一定的影响。氮源为胰蛋白胨的培养基培养下的黑皮鸡枞菌菌丝生长最快，是0.739 cm/d，最慢的是玉米粉为氮源的培养基，生长速率是0.421 cm/d，所以优选出最佳氮源为胰蛋白胨。

图3 不同氮源的黑皮鸡枞菌菌丝日生长速率Fig.3Mycelium growth rate of Termitomyces albuminosus from different nitrogen

2.1.4 氮源含量的影响

氮源的不同量黑皮鸡枞菌菌丝日生长速率见图4。

图4 氮源的不同量黑皮鸡枞菌菌丝日生长速率Fig.4Mycelium growth rate of Termitomyces albuminosus from different amount of nitrogen

由图4可知，当胰蛋白胨含量为4 g/L的时候，黑皮鸡枞菌日生长速率最大，其次是2 g/L和3g/L，所以优选出3个氮源含量为：2、3、4 g/L。

2.2 响应面试验设计

按照Design Expert 8.05 b软件中的Box-Behnken Design方法，经拟合后得到的回归方程为：菌丝日生长速率=0.90+0.11A+0.013B+0.016C+3.750×10-3AB+ 0.016AC+2.000×10-3BC－0.10A2-0.093B2－0.14C2。Box-Behnken试验设计及结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2Design and results of Box-Behnken design

续表2Box-Behnken试验设计及结果Continue table 2Design and results of Box-Behnken design

在本试验中，模型显著性检验P<0.0001，表明该模型具有统计学意义。R2=0.987 4，说明该模型可以被运用，能够在试验预测的实际范围内。响应面试验方差分析见表3。

表3 响应面试验方差分析Table 3The variance analysis result of response test

由表3可知其自变量一次项A，二次项A2、B2、C2显著（P<0.05），而自变量一次项B、C，二次项AB、AC、BC不显著。进一步分析就是碳源-果糖的含量对黑皮鸡枞菌菌丝生长速率表现显著，而氮源-胰蛋白胨的含量和生长因子VB1的含量对黑皮鸡枞菌菌丝生长速率作用不显著。

果糖含量、胰蛋白胨含量对菌丝生长速率影响的响应面-3D图见图5，果糖含量、胰蛋白胨含量对菌丝生长速率影响的响应面-等高线图见图6，果糖含量、VB1的含量对菌丝生长速率影响的响应面-3D图见图7，果糖含量、VB1的含量对菌丝生长速率影响的响应面-等高线图见图8，胰蛋白胨含量、VB1含量对菌丝生长速率影响的响应面-3D图见图9，胰蛋白胨含量、VB1含量对菌丝生长速率影响的响应面-等高线图见图10。

图5 果糖含量、胰蛋白胨含量对菌丝生长速率影响的响应面-3D图Fig.5Response surface of the content of fructose and tryptone to the growth rate of mycelium-3D

图6 果糖含量、胰蛋白胨含量对菌丝生长速率影响的响应面-等高线图Fig.6Response surface of the content of fructose and tryptone to the growth rate of mycelium-contour

图7 果糖含量、VB1的含量对菌丝生长速率影响的响应面-3D图Fig.7Response surface of the content of fructose and VB1to the growth rate of mycelium-3D

图8 果糖含量、VB1的含量对菌丝生长速率影响的响应面-等高线图Fig.8Response surface of the content of fructose and VB1to the growth rate of mycelium-contour

图9 胰蛋白胨含量、VB1含量对菌丝生长速率影响的响应面-3D图Fig.9Response surface of the content of tryptone and VB1to the growth rate of mycelium-3D

图10 胰蛋白胨含量、VB1含量对菌丝生长速率影响的响应面-等高线图Fig.10Response surface of the content of tryptone and VB1to the growth rate of mycelium-contour

最终响应面设计试验得到最佳固体培养基配方为：果糖22.71 g/L，胰蛋白胨3.08 g/L，VB12.09 mg/L，琼脂20 g，1 000 mL的水，自然pH的条件下，菌丝日生长速率可达到0.93 cm/d。根据实际试验情况将最优配方改良为：果糖23 g/L，胰蛋白胨3 g/L，ffffdf2 mg/L，琼脂20 g，1 000 mL的水，自然pH的条件下，最后用此条件在培养箱中培养后，经测量得黑皮鸡枞菌丝生在速率达到0.9 cm/d，与理论值相差不大，说明理论值具有一定可信度和可行性。

3 结论

本文通过单因素试验和响应面设计试验结果分析，碳源-果糖含量的选择对黑皮鸡枞菌菌丝生长有很大的影响，而氮源-胰蛋白胨的含量和VB1的含量对其没有多大影响，可能是碳源在培养基中占很大的成分，氮源和生长因子所占比例较小，所以影响不大。所以，当固体培养基成分是琼脂20 g，果糖23 g/L，胰蛋白胨3 g/L，2 mg/L，1 000 mL的水，自然pH的条件下，是最适合黑皮鸡枞菌菌丝生长的。

[1]薛林浩,王晓东,蔡虹,等.黑皮鸡枞菌液体培养基优化[J].内江师范学院学报,2013,28(10)：24-27

[2]邹盛勤,陈武.食用菌的营养成分·药理作用及开发利用[J].安徽农业科学,2005,33(3)：502-503

[3]卯晓岚.中国大型真菌[M].郑州：河南科学技术出版社,2000

[4]付子艳,李荣春.鸡枞菌属关系的初步研究[J].福建农林大学学报(自然科学版),2009,38(3)：271-274

[5]胡尚勤,刘天贵,李贤柏.鸡枞菌的培养条件研究[J].食品与生物技术学报,2008,27(1)：67-70

[6]曾先富,陈阳婷,熊维全,等.鸡枞菌菌丝体培养试验[J].食用菌, 2012,34(6)：9-10,18

[7]赵守光,刘小康,陈明达,等.鸡枞菌引种驯化栽培试验[J].中国食用菌,1998,17(3)：11-13

[8]张玉金,郭华春.鸡枞的驯化栽培现状微生物学报[J].微生物学报,2010,50(10)：1288-1292

[9]陆建明,张锡凤.食用菌液体菌种制备的研究进展[J].中国食用菌,2003,22(6)：15-17

[10]罗海凌,林兴生,林辉,等.不同pH值的菌草培养基对4种真菌菌丝生长的影响[J].广西科学院学报,2007,23(3)：166-167

[11]魏晓梅,胡尚勤,韦伟,等.鸡枞菌菌丝体在不同条件下蛋白质合成量的分析[J].食品科技,2007,32(8)：74-77

[12]施渺筱,李祝,杨坤耀,等.野生鸡枞菌子实体不同部位营养成分分析[J].食品研究与开发,2012,33(2)：182-183

[13]罗晓妙.液态发酵产鸡枞菌菌丝体的条件优化[J].食品科技,2010, 35(3)：29-33

The Optimization of Solid Medium of the Termitomyces albuminosus

XU Bing，ZHANG Yu-qin，JI Hong*
（College of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

The Termitomyces albuminosus mycelia growth rate was used as evaluation index，and the single factor test was used to optimize the carbon source，the concentration of carbon source，the nitrogen source and the amount of nitrogen source.Then the optimal solid medium was obtained by response surface methodology.The optimized solid culture medium component were agar 20 g/L，fructose 23 g/L，tryptone 3 g/L，VB12 mg/L，the natural pH value.The Termitomyces albuminosus mycelia growth rate reached up to 0.9 cm/d under the original fermentation conditions.

Termitomyces albuminosus；solidmedium；single factor；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.040

2016-07-20

常熟理工学院青年基金项目（QZ1504）；苏州市项目（SNG201615）

徐兵（1982—），男（汉），实验师，学士，研究方向：食用菌学。

*通信作者：冀宏（1969—），男（汉），教授，博士，研究方向：食、药用菌。