肾虚证骨质疏松与β-Catenin信号传导通路的相关性研究❋

肖延华，唐德志

(1. 井冈山大学，江西 吉安 343009；2. 上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032)

【实验研究】

肾虚证骨质疏松与β-Catenin信号传导通路的相关性研究❋

肖延华1，唐德志2

(1. 井冈山大学，江西 吉安 343009；2. 上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032)

目的：探索肾虚证骨质疏松与β-Catenin信号传导通路之间的相关性。方法：去卵巢复制肾虚证骨质疏松动物模型，将Topgal转基因小鼠、野生型小鼠、Axin2基因敲除小鼠分别按随机数字表法分为假手术组和模型组，于造模1个月后分离相应组织进行X-gal染色和细胞β-gal活性检测以及Micro-CT扫描分析骨量。结果：与假手术组比较，肾虚证模型组Topgal转基因小鼠肾脏组织和骨髓间充质干细胞中β-Catenin信号传导通路的活性均被明显抑制。Micro-CT检测结果发现，通过Axin2基因敲除可明显抑制小鼠去卵巢所致的胫骨骨量减少。结论：肾虚型骨质疏松症的发病病理机制与β-Catenin信号传导通路失活密切有关，通过激活β-Catenin信号传导通路可明显抑制肾虚引起的骨质疏松。

肾虚；骨质疏松；β-Catenin；信号传导通路；去卵巢

“肾主骨”理论是中医脏腑理论的核心内容之一，在防治骨质疏松症方面具有重要的理论和临床价值。中医学关于“肾主骨”的辨证论治积累了丰富的诊疗经验，至今仍然发挥着重要作用，但是对于“肾主骨”理论的现代科学内涵仍未清楚。现代研究发现，β-链蛋白(β-Catenin)信号传导通路在调节骨量方面具有关键作用。本研究利用Topgal转基因小鼠(β-Catenin信号传导通路报告基因小鼠)和Axin2基因敲除小鼠(β-Catenin信号传导通路活性增强小鼠)，深入研究肾虚骨质疏松症的发病机制，进一步揭示“肾主骨”理论的内在规律。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

所有的小鼠实验研究均按照上海中医药大学附属龙华医院动物实验伦理审查委员会核准的程序进行。选择8只雌性6月龄Topgal转基因小鼠，按随机数字表法分为模型组和假手术组各4只；选择20只雌性6月龄Axin2基因敲除小鼠和20只雌性6月龄野生型小鼠，分别按随机数字表法分为模型组和假手术组各10只。

1.2 药品及试剂

胎牛血清(美国PAA公司)，a-MEM干粉培养基(Invitrogen公司)，青-链霉素(美国PAA公司), 吐温-80、乙醇、多聚甲醛、二甲苯、甲醛、甲基丙桸酸甲酯等生化试剂(上海思吉公司)，X-gal染色试剂盒(美国Sigma公司)和细胞β-gal活性检测试剂盒(美国Sigma公司)等。

1.3 实验仪器

细胞培养箱(热能公司)、SW-CJ-2FD超净工作台(AIRTECH公司)、倒置相差显微镜(Olympus公司)、AF100制冰机(SCOTMAN公司)、高速离心机(Eppendorf公司)、VivaCT 40Micro-CT(Scanco Medical AG公司)、LEICA SM 2500E组织切片机(LEICA公司)和FLUO-STAR荧光检测仪(Promega 公司)等。

1.4 造模方法

肾虚证动物模型采用去卵巢小鼠模型。小鼠经氯胺酮(0.1 g/kg)腹腔注射麻醉后取俯卧位，肋弓下第3～4腰椎处剔净鼠毛，碘伏消毒，无菌操作下经腰背侧正中入路进入，钝性分开腰部筋膜、肌肉，切开腹膜分离暴露卵巢，结扎输卵管和周围血管后摘除卵巢，然后按相同方法摘除对侧卵巢。在确保摘除双侧卵巢后逐层缝合腹膜至皮肤，庆大霉素注射伤口。假手术组不摘除卵巢，仅摘除双侧卵巢旁边少许脂肪组织。

1.5 组织X-gal染色和细胞β-gal活性检测

将Topgal转基因小鼠按上述方法造模，于造模1个月后处死小鼠，分别取肾脏和卵巢组织进行X-gal染色，以检测β-Catenin信号的表达情况。同时分别取股骨和胫骨，剔净周围软组织。剪除两端骨组织暴露骨髓腔，缓慢从一端注入含 10% FBS、100 U/ml青-链霉素的高糖α-MEM细胞培养基，以分离获得骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs)。将细胞以1×106个/ml的密度接种在6孔培养板上，置于37℃ 5%CO2培养箱中培养，每3 d换液1次。待细胞长满时裂解细胞提取蛋白，按照细胞β-gal活性检测试剂盒说明书进行β-gal活性检测。

1.6 Micro-CT分析

将Axin2基因敲除小鼠和野生型小鼠分别按上述方法造模，于造模1个月后处死小鼠取胫骨组织进行Micro-CT扫描，10 μm的分辨率，55 kVp，145 mA，300 ms。简而言之，在股骨扫描从较低的生长板开始10 μm向下延伸350层，形态学分析从生长板完全暴露为第1层开始延伸到150层。然后每层自动成像，重建三维结构和形态学分析，并采用μCT评估软件系统定量分析骨体积分数BV/TV (%)。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 组织切片X-gal染色

图1显示，在假手术组Topgal转基因小鼠的双侧卵巢组织中存在较多的X-gal染色阳性信号，表明在正常的卵巢组织中β-Catenin信号传导通路保持着较高水平的激活状态，以维持卵巢的功能。在肾虚证模型组Topgal转基因小鼠由于双侧卵巢均被摘除，导致这种激活的β-Catenin信号则完全消失。结果提示，肾虚证小鼠模型卵巢组织中β-Catenin信号传导通路的活性降低。

图1 假手术组Topgal转基因小鼠双侧卵巢组织X-gal染色比较

图2显示，在假手术组Topgal转基因小鼠的双侧肾脏组织中亦存在较多的X-gal染色阳性信号，表明在正常的肾脏组织中β-Catenin信号传导通路保持着较高水平的激活状态，以维持肾脏的功能。在去卵巢所致的肾虚证模型组Topgal转基因小鼠的双侧肾脏组织中，X-gal染色阳性信号则显著减少，表明在肾虚证动物模型的肾脏组织中β-Catenin信号传导通路的活性被明显抑制，导致肾脏失去正常的功能。结果提示，肾虚证小鼠模型肾脏组织中β-Catenin信号传导通路的活性降低。

图2 各组Topgal转基因小鼠双侧肾脏组织X-gal染色比较

2.2 细胞β-gal活性检测

表1显示，与假手术组Topgal转基因小鼠比较，模型组小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中β-gal活性明显减少(P<0.05)，表明在肾虚证动物模型BMSCs中β-Catenin信号传导通路的活性被明显抑制，导致BMSCs的增殖和分化发生异常。

组 别鼠数细胞β⁃gal活性变化假手术组41 02±0 11模型组40 39±0 07∗

注：与假手术组比较:*P<0.05

2.3 胫骨Micro-CT检测

图3显示，从胫骨骨小梁三维重建结果可以看出，与假手术组野生型小鼠比较，模型组野生型小鼠骨量明显减少，假手术组Axin2基因敲除小鼠骨量明显增加。

表2显示，从胫骨骨体积分数(BV/TV)定量分析结果可以看出，与假手术组野生型小鼠比较，模型组野生型小鼠BV/TV明显减少(P<0.05)。与假手术组基因敲除小鼠比较，模型组基因敲除小鼠BV/TV明显减少(P<0.05)。与假手术组野生型小鼠比较，假手术组基因敲除小鼠骨量明显增加(P<0.05)。与模型组野生型小鼠比较，模型组基因敲除小鼠骨量明显增加(P<0.05)。这些结果表明，Axin2基因敲除可抑制因去卵巢而引起的骨量减少，提示激活β-Catenin信号传导通路在治疗肾虚型骨质疏松症中具有重要价值。

图3 各组小鼠胫骨Micro-CT检测比较

3 讨论

中医学所说的“肾”实际包括现代医学泌尿系统、生殖系统功能，而且还与神经、内分泌、血液等系统密切相关，包括现代医学中的肾脏。从胚胎学等方面也证明，肾与骨在发生学上是同源器官，皆发生于中胚层[1]。现代生理病理学研究表明，肾与骨的联系存在物质基础，主要表现在以下两个方面：一是通过肾小管上皮细胞的1-羟化酶系统和24-羟化酶系统介导活性维生素D来调节钙、磷的吸收和代谢。慢性肾功能不全(chronic renal insufficiency, CRI)患者往往出现一系列骨病和钙磷代谢紊乱，称为肾性骨营养不良(Hypoparathyroidismrenal osteodystrophy)或肾性骨病(Enal osteodystrophy)；二是内分泌系统及其分泌的激素，如肾上腺皮质激素、生长激素、甲状旁腺素和性激素等，与骨的生长、发育和代谢有着十分密切的关系[2-3]。沈自尹院士等采用“同病异证组”进行观察发现，肾阳虚证患者尿17羟皮质类固醇值(反映肾上腺皮质功能)均明显低下，从而证明肾阳虚证有特定的内分泌物质基础。目前对于钙磷代谢和内分泌激素调节在“肾主骨”理论中如何发挥作用的研究较多，但对于细胞因子、细胞信号传导通路如何参与调控“肾主骨”的研究较少。

组 别野生型小鼠基因敲除小鼠鼠数BV/TV(%)鼠数BV/TV(%)假手术组108 1±0 91012 6±1 5∗模型组104 2±0 7∗108 1±0 8﹟△

注：与假手术组野生型小鼠比较:*P<0.05；与假手术组基因敲除小鼠比较:﹟P<0.05；与模型组野生型小鼠比较:△P<0.05

近年来越来越多的研究结果表明[4]， Wnt/β-Catenin信号传导通路在肾脏和骨的形成和发育及功能代谢活动中具有重要作用[5-7]。有学者利用携带有β-Catenin特异性靶基因TCF/β-gal启动子的转基因小鼠(Topgal转基因小鼠)研究发现，Wnt/β-Catenin信号传导通路活性在肾小管的形成过程中保持着较高的水平，Wnt4和Wnt9b在肾间质、肾小管和输尿管中均高表达。体外培养的肾小管上皮细胞(madin-darby canine kidney，MDCK)中，Wnt4可激活经典的Wnt/β-Catenin信号传导通路[8]。在肾祖母细胞中特异性敲除β-Catenin导致肾单位的数量减少和结构紊乱。从前面论述中可知，Wnt/β-Catenin信号传导通路亦在调控骨发生、发育和重塑过程中具有重要作用。这些研究结果表明，Wnt/β-Catenin信号传导通路可能与中医“肾主骨”理论密切相关。

为研究中医“肾主骨”理论的内在规律，首先必须建立一个理想的肾虚证骨质疏松实验动物模型。实验动物去卵巢后雌激素缺乏导致骨丢失，其病变过程、转归与妇女绝经后骨质疏松非常相似，通过摘除双侧卵巢以建立肾虚证骨质疏松动物模型已得到公认并广泛采用[9]。本实验利用去卵巢小鼠肾虚证骨质疏松动物模型发现，β-Catenin信号传导通路的活性在肾虚型骨质疏松性小鼠的肾脏和骨髓间充质干细胞中显著下降，说明肾虚证骨质疏松症的发病病理机制与β-Catenin信号转导通路失活密切相关。

Axin2是β-Catenin信号传导通路的负向调控因子，通过敲除Axin2基因可以持续性激活β-Catenin信号传导通路[10]。为进一步研究β-Catenin信号传导通路在肾虚引起的骨量丢失中的作用，我们分别对雌性6月龄Axin2 基因敲除小鼠和同窝出生的野生型小鼠实施去卵巢摘除手术，术后4周处死小鼠，取胫骨组织进行Micro-CT扫描分析发现，Axin2基因敲除可以显著逆转由于去卵巢导致的骨量丢失。这一结果说明，通过激活β-Catenin信号传导通路，可明显抑制肾虚引起的骨质疏松，进一步表明β-Catenin信号传导通路在参与调控“肾主骨”过程中具有重要作用。肾精充足，则β-Catenin信号传导通路处于较高水平的激活状态，使骨髓生化有源，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，从而导致骨骼得到骨髓的滋养而坚固有力。若肾精不足，则β-Catenin信号传导通路活性降低，使骨髓生化失源，骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化发生障碍，不能营养骨骼，从而导致骨质疏松。这可能是中医“肾主骨”理论的内在规律之一。

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国家自然科学基金面上项目(81473701)-健脾补肾方调控肌肉微环境治疗骨质疏松性骨折的研究；上海市卫生系统新优青培养计划项目(XYQ2013085)-益气化瘀补肾方及拆方介导β-catenin信号通路延缓关节软骨退变的机制研究

肖延华(1980-)，男，江西吉安人，主治医师，医学学士，从事中医骨伤科疾病的防治研究。

△通讯作者：唐德志，Tel: 021-64286239，E-mail: dztang702@126.com。

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1006-3250(2017)04-0474-03

2016-08-17