慢性应激对大鼠凝血功能和血小板活化的影响及电针的干预作用

宋洪涛，武忠，张瑞霞，赛音朝克图，景泉凯，姚海江

慢性应激对大鼠凝血功能和血小板活化的影响及电针的干预作用

宋洪涛1，武忠1，张瑞霞1，赛音朝克图2，景泉凯3，姚海江4,5

目的观察慢性应激抑郁模型大鼠血浆凝血功能变化以及电针的干预作用。方法雄性Sprague-Dawley大鼠32只，适应性饲养1周后，随机分成空白组、模型组、氟西汀组、电针组，每组8只。后三组采用慢性应激刺激结合孤养21 d建立大鼠抑郁模型，氟西汀组、电针组分别同时采用氟西汀、电针进行干预。测定各组大鼠凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)；酶联免疫吸附测定检测大鼠6酮前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)、P-选择素、血栓烷素B2(TXB2)的变化。结果模型组旷场试验水平运动次数和垂直运动次数较空白组明显降低(P<0.01)，电针组和氟西汀组较模型组明显增加(P<0.01)。与空白组比较，模型组PT、APTT、TT明显缩短(P<0.01)，FIB含量升高(P<0.05)；血清6-keto-PGF1α含量降低(P< 0.05)，P-选择素、TXB2含量明显升高(P<0.01)；与模型组比较，氟西汀组、电针组PT、APTT、TT延长(P<0.05)，血清6-keto-PGF1α含量升高(P<0.01)，P-选择素、TXB2含量降低(P<0.05)，电针组FIB含量降低(P<0.05)。结论慢性应激抑郁模型大鼠凝血功能增强，血小板活化功能异常，电针和氟西汀可改善这些变化。

抑郁；电针；凝血功能；血小板活化；大鼠

[本文著录格式]宋洪涛，武忠，张瑞霞，等.慢性应激对大鼠凝血功能和血小板活化的影响及电针的干预作用[J].中国康复理论与实践,2017,23(3):304-307.

CITED AS:Song HT,Wu Z,Zhang RX,et al.Alteration of coagulation function and platelet activation in chronicity stress depression model rats and effect of electroacupuncture[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(3):304-307.

心理因素在身体健康中发挥重要作用。近年来人们逐渐认识到，作为一种情感障碍类疾病，抑郁症影响着心血管疾病的发生与发展[1]。抑郁症患者血小板活性增强，而血小板凝聚功能异常与心血管疾病密切相关，推测血小板功能异常在抑郁与心血管疾病之间发挥重要作用[2]。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组

清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠32只，体质量(200±10)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，使用许可证号SCXK(京)2016-0001。大鼠自由进食进水，自然昼夜光照环境，适应性饲养1周。行旷场试验(open field test)，剔除行为静止和过于活跃的大鼠，再采用随机数字表法将大鼠分成空白组、模型组、氟西汀组和电针组，每组8只。

1.2主要仪器与试剂

LG-PABER型血小板聚集及凝血因子分析仪：北京世帝科学仪器公司。V2.3酶标仪：MULTISKAN EX PRIMARY EIA。凝血酶原时间(prothrombin time, PT)试剂盒(批号20160407)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)试剂盒(批号20160413)、凝血酶时间(thrombin time,TT)试剂盒(批号20160422)、纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)试剂盒(批号20160402)：南京建成生物科技有限公司。大鼠6酮前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)酶联免疫吸附(enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA)试剂盒(货号abx051885)：ABBEXA公司。大鼠P-选择素ELISA试剂盒(货号ELR-Pselectin-1)：RAYBIOTECH公司。大鼠血栓烷素B2(thromboxane B2,TXB2)ELISA试剂盒(货号ADI-900-002)：ENZO公司。盐酸氟西汀胶囊：礼来苏州制药有限公司。LH202型韩氏穴位神经刺激仪：北京华卫产业有限公司。

1.3模型制备[3-4]

共用7种应激因子：①断食24 h；②断水24 h；③潮湿垫料24 h；④昼夜颠倒24 h；⑤4℃冷水游泳5 min；⑥距尾尖2 cm处夹尾3 min；⑦30 V电击足底5 s。每天随机给予1种刺激因子进行应激，平均每种刺激3次。大鼠单独饲养于铁笼内(孤养)。共21 d。

1.4处理方法

空白组：群养，不造模及干预。模型组：单纯造模。氟西汀组：造模同时灌胃给药，盐酸氟西汀以生理盐水配成1 mg/ml，每天2 mg/kg。电针组：孤养，应激刺激前1 h电针百会和印堂，频率2 Hz，电流1 mA，每次20 min。共干预21 d。

1.5旷场试验

分别于实验前1 d以及实验第22天行旷场试验。箱体规格为80×80×40 cm，箱底及四壁涂成黑色，用白线将底面横纵各分5等分，形成25个16×16 cm的正方形。提拉大鼠尾端，将大鼠置于中心方格固定位置，待大鼠情绪稳定后放开大鼠，人在距离大鼠1 m外观察大鼠3 min内的水平运动次数(大鼠穿越箱底方格的次数)和垂直运动次数(大鼠直立或攀墙的次数)。

检测前后均彻底清洗箱内，保证每只动物不受前只大鼠的影响。

1.6样品制备和检测方法

1.6.1PT、APTT、TT、FIB检测

行为学检测结束后，大鼠断头取血2 ml，置于含1∶9柠檬酸钠溶液0.2 m1的测定管中，轻轻颠倒混合10次。4℃、3000 r/min离心15 min，-20℃保存待测。利用LG-PABER型血小板聚集及凝血因子分析仪检测大鼠PT、APTT、TT和FIB。

1.6.26-keto-PGF1α、P-选择素、TXB2检测

行为学检测结束后，大鼠断头取血2 ml，4℃、3000 r/min离心15 min，-20℃保存待测。严格按照试剂盒说明书检测6-keto-PGF1α、P-选择素、TXB2。

1.7统计学分析

应用SPSS 13.0软件对数据进行统计学处理。实验结果以(±s)表示，采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1旷场试验

实验前，各组大鼠水平运动及垂直运动水平无显著性差异(P>0.05)。应激刺激后，模型组水平及垂直运动次数较空白组明显减少(P<0.01)。与模型组比较，氟西汀组水平及垂直运动次数明显升高(P< 0.01)，电针组水平及垂直运动次数也明显升高(P< 0.01)。见表1。

2.2PT、APTT、TT、FIB

与空白组比较，模型组大鼠血浆PT、APTT、TT时间明显缩短(P<0.01)，FIB含量升高(P<0.05)；与模型组比较，氟西汀组PT、APTT、TT时间延长(P< 0.05)，FIB含量无显著性差异(P>0.05)，电针组PT、APTT、TT时间延长(P<0.05)，FIB含量降低(P< 0.05)。见表2。

2.36-keto-PGF1α、P-选择素、TXB2

与空白组比较，模型组血清6-keto-PGF1α含量降低(P<0.05)，P-选择素及TXB2含量明显升高(P< 0.01)；与模型组比较，氟西汀组6-keto-PGF1α含量明显升高(P<0.01)、P-选择素及TXB2含量下降(P< 0.05)，电针组6-keto-PGF1α含量有上升趋势，但无显著性差异(P>0.05)，P-选择素及TXB2含量明显下降(P<0.01)。见表3。

3 讨论

抑郁症患者多伴有5-羟色胺系统功能异常，血小板活性和凝聚力均高于非抑郁症者[5]。血小板活化功能异常与心血管疾病密切相关[6]，多项研究也表明，抑郁症患者较正常人群的血小板活性[7]、P-选择素的反应性[8-9]增强。抗抑郁药可降低患者血小板聚集程度[10]、抑制血小板活性[11]。因此，有学者认为抑郁症和心血管疾病存在着共同的病理生理改变，即血小板活性增强[12]。

表1 各组大鼠旷场试验水平运动及垂直运动情况比较

表2 各组大鼠血PT、APTT、TT、FIB比较

表3 各组大鼠血6-keto-PGF1α、P-选择素、TXB2比较

PT、APTT、TT、FIB是检测凝血功能最常用的指标。其中PT、APTT分别是外源性凝血因子、内源性凝血因子的筛查试验，FIB是凝血过程中的主要蛋白质，TT检查血浆内纤维蛋白原水平及血浆中肝素样物质的多少，当FIB水平增多时，TT缩短[13-14]。

TXA2是目前发现最强的缩血管物质与血小板聚集剂之一，可以激活血小板，使其聚集。PGI2是较强的血小板聚集抑制剂，具有抑制血小板促凝活性作用。TXA2与PGI2的动态平衡影响血小板聚集功能和血管舒缩功能。由于TXA2和PGI2性质不稳定，我们通过检查它们的代谢产物TXB2和6-keto-PGF1α来判断其水平。P-选择素是血小板活化后期的标志物，参与血小板黏附与聚集过程，可作为血小板活化的特异性标志[15-16]。

本研究显示，慢性应激结合孤养21 d后，大鼠探究行为和运动能力降低，表现出抑郁状态，模型复制成功。抗抑郁药及电针干预均有改善抑郁的作用。

抑郁模型大鼠PT、APTT、TT时间缩短，FIB含量升高，提示凝血功能紊乱；抗抑郁药物及电针治疗可抑制凝血酶原向凝血酶的转化，进而间接抑制纤维蛋白原向纤维蛋白的转变。

抑郁大鼠TXB2含量升高，6-keto-PGF1α含量降低，P-选择素含量升高，提示血小板活化异常；抗抑郁药物及电针均可以改善抑郁大鼠的血小板功能。

目前临床抗抑郁药物主要为选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitor,SSRI)和5-羟色胺/去甲肾上腺素再摄取抑制剂(serotonin& norepinephrine reuptake inhibitor,SNRI)两类。SSRI类药物会出现焦虑、失眠、性欲减退、恶心等不适症状[17]，SNRI类药物会出现恶心、头痛、头晕、嗜睡、虚弱、食欲减退，甚至5-羟色胺综合征等不良反应[18]。针刺通过多层次、多靶向对机体进行综合调节[19]。研究表明，针刺与氟西汀治疗抑郁症疗效相当，但不良反应轻微短暂[20-21]。

中医学认为，抑郁症是髓海亏虚、神机紊乱失调所致，病位在脑。督脉循行过脑，为全身阳脉之海，具有总领阳气、通脉醒神的作用[22]。本研究选取临床使用频率最高的百会、印堂两穴，其抗抑郁作用在临床和基础实验中均已证实[23-25]。本研究显示，电针印堂、百会在改善抑郁的同时，也对抑郁大鼠的凝血功能及血小板功能异常有改善作用，这可能与其发挥抗抑郁作用有关。

我们认为，机体在抑郁状态下，存在血小板活化途径过度激活，进而影响心血管事件的发生。电针可以改善抑郁状态及血小板功能异常，安全有效，值得在临床推广。其具体机制还需进一步研究。

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Alteration of Coagulation Function and Platelet Activation in Chronicity Stress Depression Model Rats and Effect of Electroacupuncture

SONG Hong-tao1,WU Zhong1,ZHANG Rui-xia1,SAIYIN Chao-ketu2,JING Quan-kai3,YAO Hai-jiang4,5
1.Inner Mongolia People's Hospital,Hohhot,Inner Mongolia 010010,China;2.Inner Mongolia International Mongolian Hospital,Hohhot,Inner Mongolia 010065,China;3.School of Acupuncture-Moxibustion and Tuina,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;4.Treatment Center of Traditional Chinese Medicine,Beijing Bo'ai Hospital,China Rehabilitation Research Center,Beijing 100068,China;5.Capital Medical University School of Rehabilitation,Beijing 100068,China

SONG Hong-tao.E-mail:renxuxing@126.com

ObjectiveTo observe the change of coagulation function in chronic stress depression model rats and the effects of electroacupuncture(EA)on it.MethodsA total of 32 Sprague-Dawley rats were randomly divided in control group(n=8),model group(n=8), EA group(n=8)and fluoxetine group(n=8)after a week of acclimation.The 21-day unpredictable mild stress combined with solitarily feeding was used to make the depression model in the latter three groups,meanwhile EA group and the fluoxetine group accepted EA and fluoxetine.They were measured the prothrombin time(PT),activated partial thromboplastin time(APTT),thrombin time(TT)and fibrinogen (FIB).Serum levels of 6-keto-prostaglandin F1α(6-keto-PGF1α),P-selectin,thromboxane B2(TXB2)were determined with enzyme-linked immunoabsorbent assay.ResultsThe cross and rear scores were significantly lower in the model group than in the control group(P<0.01).The scores increased in EA group and the fluoxetine group(P<0.01)compared with the model group.Compared with the control group,PT, APTT and TT decreased(P<0.01),FIB increased(P<0.05),the level of 6-keto-PGF1αdecreased,the level of P-selectin and TXB2increased (P<0.01)in the model group.Compared with the model group,PT,APTT and TT increased(P<0.05),the level of 6-keto-PGF1αincreased (P<0.01),and the level of P-selectin and TXB2decreased(P<0.05)in EA group and the fluoxetine group,and FIB decreased in EA group (P<0.05).ConclusionThe chronic stress depression rats are impaired in the coagulation function and platelet activation,and can be allayed with electroacupuncture and fluoxetine.

depression;electroacupuncture;coagulation function;platelet activation;rats

[中图分类号]R749.7

A

1006-9771(2017)03-0304-04

2016-10-12

2016-12-23)

内蒙古自治区人民医院院内基金项目(No.201557)。

1.内蒙古自治区人民医院，内蒙古呼和浩特市010010；2.内蒙古国际蒙医医院，内蒙古呼和浩特市010065；3.北京中医药大学针灸推拿学院，北京市100029；4.中国康复研究中心北京博爱医院中医治疗中心，北京市100068；5.首都医科大学康复医学院，北京市100068。作者简介：宋洪涛(1982-)，男，蒙古族，内蒙古赤峰市人，博士，主治医师，主要研究方向：针刺干预中枢神经损伤的机理研究。E-mail:renxuxing@126.com。

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.03.011