Th22细胞及相关因子在重症肌无力患者外周血中的表达

秦航 林烨 常婷 郭鹏 李柱一

Th22细胞及相关因子在重症肌无力患者外周血中的表达

秦航 林烨 常婷 郭鹏 李柱一

目的 研究重症肌无力(myasthenia gravis，MG)患者外周血辅助性T细胞22(T helper 22 cells,Th22)和白细胞介素-22(interleukin-22，IL-22)的表达以及两者间的相关性。方法 收集25例MG患者和24例健康对照者，其中眼肌型重症肌无力(ocular myasthenia gravis，OMG)患者14例，全身型重症肌无力(general myasthenia gravis，GMG)患者11例。采用流式细胞仪检测MG患者和健康对照者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中Th22细胞的比例，采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测血浆IL-22的表达。比较各组间Th22细胞比例和IL-22表达水平差异，以及Th22细胞比例和IL-22表达间的相关性。结果 MG患者PBMC中Th22细胞比例、血浆IL-22表达水平均显著低于健康对照组〔(0.60±0.07)%比(0.92±0.09)%，P<0.01；(18.65±1.38)pg/mL比(24.54±1.85)pg/mL，P<0.05〕；OMG与GMG患者间Th22细胞比例、IL-22表达水平均无统计学差异(均P>0.05)；MG患者PBMC中Th22细胞比例与IL-22表达水平间呈中度正相关(r=0.59，P<0.01)。结论 MG患者体内Th22细胞比例及血浆IL-22表达水平减低可能导致免疫功能紊乱进而影响MG的发病。

重症肌无力；T淋巴细胞亚群；辅助性T细胞22；白细胞介素22

重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是一种T细胞依赖、B细胞介导、补体参与的获得性自身免疫性疾病，主要由乙酰胆碱受体抗体(acetylcholine receptor antibody，AChR-Ab)介导引起神经肌肉接头传递障碍所致[1-2]。研究表明CD4+辅助性T细胞可辅助浆细胞产生AChR-Ab[3]，Ahlberg等[4]也曾报道通过人鼠嵌合抗CD4单克隆抗体可改善MG患者症状，可见CD4+辅助性T细胞在MG的发生中起至关重要的作用。

辅助性T细胞22(T helper 22 cells，Th22)作为一种新型CD4+辅助性T细胞亚群，主要分泌特征性的细胞因子——白细胞介素-22(interleukin-22，IL-22)，但不分泌IL-17和γ干扰素(IFN-γ)，细胞表型为CD4+IL-22+IL-17-IFN-γ-[5]。人体内的IL-22主要由Th22细胞分泌，它是Th22细胞发挥免疫调节作用的主要效应因子[5-7]。Th22细胞与很多自身免疫性疾病的发病机制有关，许多自身免疫性疾病患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中Th22细胞比例及血浆IL-22表达水平较健康者升高[8]，然而在狼疮肾炎患者中Th22细胞和IL-22却显著下降[9]。目前，尚未检索到国内外有关Th22细胞在MG发病中作用的研究。本研究通过检测MG患者外周血Th22细胞及IL-22的表达，旨在探究Th22细胞在MG发病机制中的作用。

1 对象和方法

1.1 研究对象 收集2015-10—2016-06在第四军医大学唐都医院神经内科门诊就诊的MG患者25例，MG确诊标准依据《中国重症肌无力诊断和治疗指南(2015)》[10]，入组患者均未进行免疫抑制剂或激素治疗，且不合并其他自身免疫性疾病。其中男性14例，女性11例，伴胸腺异常5例(胸腺瘤4例，胸腺增生1例)，年龄3.8～82岁，平均(40.4±3.2)岁。所有患者进行MGFA分型，其中Ⅰ型14例，Ⅱa型5例，Ⅱb型5例，Ⅲa型1例。Ⅰ型患者定义为眼肌型重症肌无力(ocular myasthenia gravis，OMG)组，另11例为全身型重症肌无力(general myasthenia gravis，GMG)组。健康对照24名，均来自作者医院体检的健康者，无自身免疫性疾病，其中男性13名，女性11名，年龄21～64岁，平均(40.1±2.7)岁。所有MG患者和健康对照均签署知情同意书。两组间性别构成和年龄间比较无统计学差异(P>0.05)。

1.2 主要试剂和仪器 流式单克隆抗体FITC-anti-human CD4、PerCP/Cy5.5-anti-human IFN-γ、APC-anti-human IL-17A、PE-anti-human IL-22及对应的同型抗体购自Biolegend公司，固定/破膜试剂及洗液为BD公司产品，离子霉素、佛波酯以及莫能霉素购自Sigma公司，人IL-22 ELISA试剂盒为Mabtech公司产品。主要仪器包括流式细胞仪(BD公司)、酶标仪(Bio-Rad公司)、离心机(Eppendorf公司)。

1.3 方法

1.3.1 PBMC中Th22细胞比例检测：采用密度梯度沉降法获取PBMC，收集约1×106个PBMC，加入离子霉素、佛波酯以及莫能霉素，置37℃、5%(体积分数)CO2多功能细胞孵育箱中孵育6 h，破膜、固定细胞，加入FITC-anti-human CD4、PerCP/Cy5.5-anti-human IFN-γ、APC-anti-human IL-17A、PE-anti-human IL-22单克隆抗体，4℃避光孵育30 min，洗涤、多聚甲醛固定后通过流式细胞仪检测CD4+IL-22+IL-17-IFN-γ-的细胞比例。同型对照组加入FITC-anti-human CD4、PerCP/Cy5.5-anti-human IFN-γ单克隆抗体，APC、PE同型抗体。

1.3.2 血浆IL-22表达检测：将前期冻于-80℃的两组血浆样本于4℃解冻，采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)进行检测，具体步骤按人IL-22 ELISA试剂盒说明书进行。

1.4 统计学处理 采用统计软件SPSS19.0进行分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两均数间比较采用t检验，Th22细胞比例与IL-22表达的相关性采用Pearson相关性分析。以双侧P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组PBMC中Th22细胞比例 MG患者PBMC中Th22细胞比例低于健康对照组〔(0.60±0.07)%比(0.92±0.09)%，P<0.01〕。OMG组患者Th22细胞比例与GMG组比较虽有升高趋势，但差异无统计学意义〔(0.64±0.10)%比(0.55±0.09)%，P>0.05〕。某例MG患者与健康对照者流式细胞术检测结果见图1。

2.2 血浆IL-22表达水平 MG患者血浆IL-22表达水平显著低于健康对照组〔(18.65±1.38)pg/mL比(24.54±1.85)pg/mL，P<0.05〕。OMG患者IL-22表达水平虽有高于GMG患者的趋势，但两组间比较差异无统计学意义〔(20.82±1.92)pg/mL比(15.89±1.69)pg/mL，P>0.05〕。

2.3 MG患者外周血Th22细胞比例与IL-22的相关性 MG患者PBMC中Th22细胞比例与血浆IL-22表达水平呈中度正相关(r=0.59，P<0.01)。结果见图2。

注：MG：重症肌无力,图2同；PBMC：外周血单个核细胞 图1 流式细胞术检测某例MG患者和健康对照PBMC中Th22细胞比例结果

注：IL-22：白细胞介素-22；IFN-γ：干扰素γ 图2 MG患者外周血Th22细胞比例与IL-22表达水平的相关性分析

3 讨论

Th22细胞在许多自身免疫性疾病中均发挥了重要作用，但有关Th22细胞在MG方面的研究目前尚未检索到。本研究对MG患者PBMC中Th22细胞比例、血浆IL-22的表达水平进行检测，并探讨了Th22细胞与IL-22表达间的关系，结果显示，MG患者PBMC中Th22细胞比例、血浆IL-22表达水平均显著低于健康对照组，MG患者PBMC中Th22细胞比例与IL-22表达水平间存在中度正相关。

Th22细胞在肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-6等细胞因子的刺激下由初始CD4+T细胞分化而来，而转化生长因子β(TGF-β)作为一种主要的内源性免疫抑制因子具有抑制Th22细胞分化的功能[5]。既往研究发现，MG合并胸腺瘤患者的瘤组织中TGF-β1表达水平较单纯胸腺瘤患者高[11]；MG患者外周血中TGF-β1也显著高于健康者[12]。TGF-β1在所有的TGF-β亚型中生物学活性最强，这似乎部分解释了MG患者PBMC中Th22细胞比例减低的原因。有研究表明IL-22与AChR-Ab之间存在显著负相关[13]。IL-22主要由Th22细胞分泌，本研究发现Th22与IL-22之间存在显著正相关，推测Th22细胞可能抑制了B细胞的功能，减少了AChR-Ab的分泌。MG患者Th22细胞减少，降低了其对B细胞的抑制，从而促进了AChR-Ab的分泌，可能导致了MG的发生发展。

IL-22作为白细胞介素-10家族中的一员，主要由Th22细胞分泌，通过IL-22R1和IL-10R2组成的异二聚体受体复合体发挥功能，IL-10R2广泛地表达于各类免疫组织细胞，但IL-22R1仅分布在某些组织细胞如骨骼肌、皮肤、小肠等[14-15]。IL-22在不同的组织中具有促进炎症或者抑制炎症的双重功效，在类风湿性关节炎[16]等疾病中，表现为促炎的功能，参与了疾病的发生发展，但在急性胰腺炎[17]、实验性自身免疫性心肌炎[18]等动物模型以及狼疮肾炎[9]患者中，IL-22却表现出抑制炎症的保护性作用。在小鼠气道炎症模型中，IL-22在气道组织中表现出促进炎症致病或抑制炎症保护的双重功效，具体取决于IL-17A的表达。当缺乏IL-17A时，表现出抑制炎症的保护性作用；当IL-22与IL-17A共表达时，表现出促炎的作用[19]。作者课题组既往研究结果显示，Th17细胞和IL-17可能参与了MG的发病，且MG患者外周血中Th17细胞比例、IL-17表达量较健康者明显升高[20]，推测MG患者IL-17的升高可能与IL-22共表达，表现出促炎的作用，从而参与了MG的发生。

芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AHR)是Th22细胞的关键转录因子。Trifari等[21]研究显示，β-萘黄酮作为AHR的激动剂，在人体内既可促进IL-22的表达，提高Th22细胞的比例，又可抑制IL-17的表达，降低Th17细胞的比例，提示Th22与Th17细胞、IL-22与IL-17之间可能存在平衡。Zheng等[13]研究亦发现MG患者血清中IL-22较健康者显著降低，IL-17显著升高，且IL-22与IL-17之间存在负相关。本文研究选取未经过任何药物治疗的新发MG患者，入组标准更加严格，并对Th22细胞在PBMC中的比例变化进行了探讨，结果显示MG患者Th22细胞比例、IL-22表达较健康对照组降低，且Th22细胞比例与IL-22呈正相关。这与上述研究结果基本一致。据此推测，Th17细胞、IL-17升高，Th22细胞、IL-22减低，这种平衡的改变可能导致了MG的发生。

综上所述，MG患者PBMC中Th22细胞比例、血浆IL-22表达水平降低，可能参与了MG的发生发展，Th22细胞和IL-22可能在MG中起保护性作用，这为将来MG的治疗可能提供了新的疗法，但有关Th22细胞及相关因子在MG发病中的免疫机制有待进一步深入研究。

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(本文编辑：时秋宽)

Changes of circulating T helper 22 cells and its related molecules in myasthenia gravis

QINHang,LINYe,CHANGTing,GUOPeng,LIZhuyi*.

*DepartmentofNeurology,TangduHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’anShaanxi710038,China

Corresponding author: LI Zhuyi, Email: lizhuyi@fmmu.edu.cn

Objective To study the expression of T helper 22 (Th22) cells and interleukin-22 (IL-22) in peripheral blood of patients with myasthenia gravis (MG); the correlation between Th22 cells and IL-22 was analyzed. Methods Twenty-five MG patients, consisting of fourteen ocular MG (OMG) patients and eleven general MG patients(GMG), were enrolled. Twenty-four healthy volunteers were used as controls. The percentages of Th22 cells in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of MG patients and healthy controls were detected by flow cytometry. The plasma levels of IL-22 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The differences of the Th22 cells percentages and the concentration of IL-22 were compared between each group; also we investigated the correlation between Th22 cells and IL-22. Results The proportion of Th22 cells and plasma IL-22 levels significantly declined in MG patients compared with healthy controls [(0.60±0.07)%vs. (0.92±0.09)%，P<0.01；(18.65±1.38)pg/mLvs. (24.54±1.85)pg/mL，P<0.05]. There were no significant differences of the proportion of Th22 cells and plasma IL-22 levels between OMG and GMG patients(allP>0.05). Moderate positive correlation was shown between the proportion of Th22 cells and plasma IL-22 levels in PBMC of MG patients(r=0.59，P<0.01).Conclusions The decreased Th22 cells and IL-22 in MG patients might lead to immune disorder, and then were involved in the pathological process of MG.

myasthenia gravis; T-lymphocyte subsets; T helper 22 cells; interleukin-22

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.03.006

国家自然科学基金资助项目(81571218)

710038 第四军医大学唐都医院神经内科

李柱一，Email: lizhuyi@fmmu.edu.cn

R746.1

A

1006-2963(2017)03-0174-04

2016-10-14)