中国2种橡胶树炭疽病菌对咪鲜胺敏感性比较

林春花 徐轩 戈玉琪 牟保辉 刘文波 缪卫国 郑服丛

摘 要 炭疽病是橡胶树上一种重要的叶部病害，主要病原有胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌。为了解中国各植胶区炭疽菌对咪鲜胺的敏感性，采用生长速率法室内测定来自海南、云南、广东和廣西4省（区）22株橡胶树胶孢炭疽病菌和15株尖孢炭疽菌对咪鲜胺的敏感性。结果表明：供试的37株橡胶炭疽病菌菌株对咪鲜胺的EC50值为0.022 0～0.272 1 mg/L，平均为（0.061 7 ±0.055 4）mg/L，EC50最大值是最小值的12.5倍。其中89.2%参试菌株的EC50值介于0～0.100 0 mg/L。根据成组t检验分析结果表明，目前中国4个植胶区的2种橡胶炭疽病菌对咪鲜胺敏感性无明显差异。除了来自海南和云南地区的尖孢炭疽菌有显著性差异外，其他来自不同省份的胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌对咪鲜胺敏感性均无明显差异。研究显示中国橡胶炭疽菌对咪鲜胺仍具有较高的敏感性，但菌株间敏感性有一定的差异，存在一定的潜在抗性风险。

关键词 橡胶树；胶孢炭疽菌；尖孢炭疽菌；咪鲜胺；敏感性

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Comparison of Sensitivity Between Two Colletotrichum Species from Hevea brasiliensis to Prochloraz in China

LIN Chunhua， XU Xuan， GE Yuqi， MOU Baohui， LIU Wenbo， MIAO Weiguo*， ZHENG Fucong*

College of Environment and Plant Protection， Hainan Universtity/Key Laboratory of Protection and

Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract Colletotrichum gloeosporioides and C. acutatum have been reported as the main pathogens of the rubber anthracnose， which is one of the main leaf diseases of rubber tree in China. Twenty-two isolates of C. gloeosporioides and 15 isolates of C. acutatum were isolated from diseased Hevea brasiliensis collected from 4 different provinces in China. The sensitivity of these isolates to prochloraz was determined by the mycelium growth rate method. The results indicated that the EC50 values of the 37 isolates ranged from 0.022 0 to 0.272 1 mg/L， with an average value of （0.061 7±0.055 4）mg/L， and the maximum EC50 value was 12.5 times as much as the minimum. Among them， the EC50 value of 33 isolates（89.2%）was from 0 to 0.100 0 mg/L. There were no significant difference between the average EC50 value of C. gloesporioides and C. acutatum to prochloraz in total. Except for the difference observed in the C. acutatum isolates between Hainan and Yunnan， there were no significant difference between the average EC50 values of the isolates from different provinces. The results indicated high sensitivity of the two Colletotrichum species to prochloraz in China， however， the potential prochloraz-resistant risk should be paid attention due to considerable variation in sensitivity to prochloraz among the isolates of Colletotrichum spp. from Hevea brasiliensis.

Key words Hevea brasiliensis； Colletotrichum gloeosporioides； C. acutatum； prochloraz； sensitivity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.019

由炭疽菌（Colletotrichum spp.）引起的炭疽病是世界范围内农业生产中发生最为普遍、危害较重的植物病害[1]。炭疽菌种类繁多，遗传多态性丰富。橡胶树炭疽病是橡胶树重要叶部病害之一，在中国植胶垦区普遍发生，其病原菌主要有胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）和尖孢炭疽菌（C. acutatum Simmons）[2-3]。这2种炭疽菌为复合种，种间及种下遗传多态性丰富，二者在生物学特性、菌落形态和保守基因序列上也都存在较大差异[4-6]。也有研究结果显示，二者在对药剂的敏感性存在差异[7]，如云南橡胶树2种炭疽病菌对咪鲜胺、多菌灵、甲基托布津敏感性有显著性差异，胶孢炭疽菌显著高于尖孢炭疽菌[7]。

咪鲜胺是属麦角甾醇生物合成脱甲基抑制剂类（DMIs）杀菌剂，通常被列为中度抗药性风险药剂[8]。长期使用单一药剂，病菌对药剂的敏感性可能降低，甚至出现抗药菌株。在水稻上已监测到高抗咪鲜胺的水稻恶苗病菌（Fusarium moniliforme）菌株[9-10]。咪鲜胺对炭疽病菌也具有很好的防治效果，在各种炭疽病的防治上广泛使用。目前对来自田间的芒果、葡萄、草莓、柑橘等炭疽病菌进行咪鲜胺敏感性测定，结果均显示菌株间对咪鲜胺的敏感性略有不同，但未见抗药性菌株[11-14]。

菌株来源不同，对药剂的敏感性可能不同。前人已报道橡胶炭疽菌对咪鲜胺的敏感性，但其供试菌株来源仅局限在单省份，如蔡志英等[7]比较分析了云南1株胶孢炭疽菌和1株尖孢炭疽菌形态及对咪鲜胺、多菌灵和甲基托布津等6种药剂的敏感性，结果显示尖孢炭疽菌对这些药剂的敏感性低于胶孢炭疽菌；曹学仁[15]对来自海南的23株胶孢炭疽菌和20株尖孢炭疽菌进行了多菌灵和咪鲜胺的敏感性测定，结果发现尖孢炭疽菌对多菌灵的敏感性要显著低于胶孢炭疽菌，但二者对咪鲜胺的敏感性无显著差异。至今未见来自不同省份橡胶炭疽菌菌株对咪鲜胺敏感性的比较研究，也未见广东和广西两省（区）橡胶炭疽菌对咪鲜胺敏感性的报道。本研究首次用来自中国4省（区）的2种橡胶树炭疽菌作为供试菌，测定其对咪鲜胺敏感性，为更全面了解国内植胶区橡胶树炭疽菌对咪鲜胺敏感性现状及病害科学防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株的分离和鉴定 于2014年12月～2015年2月间在海南、云南、广东和广西橡胶四垦区随机采集炭疽病叶带回实验室，采用常规植物病理学方法进行病原菌分离和致病力测定。将各菌株利用科赫氏法则测定显示具有致病力，并通过分生孢子形态和基于rDNA-ITS、ACT、GAPDH和CHS-1分析进行菌种鉴定[16]。供试菌株的来源地及菌株鉴定信息见表1，含22株胶孢炭疽菌和15株尖孢炭疽菌。

1.1.2 供试药剂 供试药剂为97%咪鲜胺原药，由海南正业中农高科股份有限公司提供。

1.1.3 供试培养基 马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉17 g，纯净水定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 含药培养基的配置 将97%咪鲜胺原药用丙酮配制为0.2 mg/mL母液，备用。向融化的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中添加不同体积的咪鲜胺母液，配置成咪鲜胺药剂质量浓度为2、0.5、0.125、0.031 25、0.007 81 mg/L浓度梯度含药培养基。

1.2.2 橡胶炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性测定 采用生长速率法测定炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性。将供试菌株在28 ℃下培养4～5 d，从菌落边缘切取直径约6 mm的菌饼，移接至含药PDA平板中央，带菌丝面朝下接触培养基，于28 ℃下培养4 d后，采用十字交叉法测量菌落直径，每个处理浓度设3次重复。

1.3 数据统计与分析

计算菌丝生长抑制率，将药剂质量浓度转换为对数值作为横坐标，抑制率转换为机率值作为纵坐标，用最小二乘法建立毒力回归方程y=ax+b，把y=5（抑制率为50%的机率值）代入毒力方程求出x，再对x进行反对数转换，计算有效抑制中浓度EC50值。利用SAS软件的成组t检验比较2种炭疽菌及来源不同省区的炭疽菌对咪鲜胺的敏感性是否具有显著性差异。其中计算公式如下：生长抑制率=[（对照菌落净生长量-处理菌落净生长量）/对照菌落净生长量]×100%；菌落净生长量/mm=菌落直径-菌饼直径。

2 结果与分析

2.1 橡胶炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性分析

参试菌株对咪鲜胺毒力回归方程、相关系数和EC50值见表2和表3。 所有参试菌株对咪鲜胺的EC50值介于0.022 0～0.272 1 mg/L，平均值為（0.061 7±0.055 4）mg/L， EC50最大值是最小值的12.5倍。其中，胶孢炭疽菌EC50值介于0.022 0～0.272 1 mg/L，平均值为（0.072 9±0.069 8）mg/L；尖孢炭疽菌EC50值介于0.028 4～0.058 2 mg/L，平均值为（0.045 1±0.009 7）mg/L；总体来说，从EC50值看，二者对咪鲜胺的敏感性水平相当，无数量级差异，但尖孢炭疽菌对咪鲜胺的敏感性略高于胶孢炭疽菌。这表明2种病菌之间无显著差异（t=1.53， p=0.135 6）。

从菌株来源看，来自海南的菌株EC50平均值最高，为（0.074 2±0.072 0）mg/L；来自云南的菌株EC50平均值最低，为（0.039 6±0.009 4）mg/L。在胶孢炭疽菌中，来自广西的菌株EC50平均值最高，为（0.091 7±0.110 0）mg/L；来自云南的菌株EC50平均值最低，为（0.041 5±0.013 5）mg/L；将各省份两两数据进行统计分析，结果显示各省份间EC50值无显著差异。在尖孢炭疽菌中，海南省与云南省尖孢炭疽菌EC50值有显著性差异（t=4.00；p=0.016 1<0.05），其余省（区）来源的尖孢炭疽菌株EC50值无显著性差异（p>0.05）（表3）。

2.2 橡胶炭疽病菌对咪鲜胺敏感性频率分布

由图1可知，在供试的37株橡胶炭疽菌中，大部分菌株的EC50介于0～0.100 0 mg/L，占总参试菌株89.2%（33/37）。其中供试的所有尖孢炭疽菌和大部分胶孢炭疽菌的EC50均介于0～0.100 0 mg/L；只有来自海南的菌株HN09、HN13、HN14和广西的GX02大于0.100 0 mg/L。该结果表明目前中国橡胶炭疽菌对咪鲜胺仍具有较高的敏感性，但菌株间敏感性有一定差异，存在一定潜在抗药性风险。

3 讨论

咪鲜胺是防治炭疽病的有效药剂之一。自20世纪90年代开始广泛使用咪鲜胺以来，鲜有病原菌产生抗药性的报道。目前在水稻上有监测到高抗咪鲜胺的水稻恶苗病菌（Fusarium moniliforme）菌株[9-10]。对来自田间的芒果、葡萄、草莓、柑橘、油梨等炭疽病菌进行对咪鲜胺敏感性测定，均未见抗药性菌株[11-14，17-18]。但王小琴[19]对芒果炭疽病菌进行室内驯化，获得1株在含12 mg/L咪鲜胺培养基能生长的具有高抗的突变体株。上述研究结果说明了炭疽菌对咪鲜胺药剂具有较高的敏感性，在大田中咪鲜胺有很好的防治效果，但有产生抗药性菌株的风险，仍需监测大田中炭疽菌对咪鲜胺的敏感性情况。

关于中国橡胶树炭疽菌对咪鲜胺的敏感性测定，主要见蔡志英等和曹学仁等的报道。蔡志英等[7]对2008年采自云南的1株胶孢炭疽菌和1株尖孢炭疽菌进行比较，胶孢炭疽菌与尖孢炭疽菌的EC50值分别为0.020 9 mg/L和0.029 0 mg/L。曹学仁等[15]检测了从海南省4个市县分离获得的43株橡胶炭疽菌对咪鲜胺的敏感性，供试菌株的EC50值分布在0.009 1～0.113 3 mg/L范围内，平均值为0.036 8 mg/L。本研究结果显示海南15株供试菌EC50值范围是0.022 8～0.272 1 mg/L，平均值为（0.074 2±0.072 0）mg/L；云南6株供试菌EC50值范围是0.031 6～0.056 9 mg/L，平均值为（0.039 6±0.009 4）mg/L。本研究结果与前人的研究结果[7，15]相比，EC50值虽无数量级差异，但平均值约为前人报道的2倍。

从不同采集地和植株部位得到的炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性不同，如杨石有等[20]对116株芒果炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性进行测定，结果显示，EC50值为0.000 8～0.073 9 mg/L，EC50最大值是最小值的92.4倍。广东芒果炭疽菌对咪鲜胺的敏感性（尤其分离自叶片的菌株）最高[20]。至今未见有人测定来自广东和广西两省（区）橡胶树炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性，也未见不同省份来源的橡胶炭疽菌对咪鲜胺的敏感性比较分析。本研究获得了广东的7株炭疽菌和广西的9株炭疽菌对咪鲜胺的EC50值，广东的菌株EC50值范围是0.032 4～0.085 9 mg/L，平均值为（0.058 6±0.018 8）mg/L；广西的菌株EC50值范围是0.022 0～0.218 5 mg/L，平均值为（0.057 9±0.611 0）mg/L；比较分析显示，除了来自云南和海南的尖孢炭疽对咪鲜胺EC50有一定差异外，不同省（区）来源的橡胶胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌对咪鲜胺的EC50差异并不明显。本研究中，由于有的省（区）菌株较少，如云南尖孢炭疽菌只有3株供试菌，因此海南和云南尖孢炭疽菌对咪鲜胺敏感性具有显著性差异这一结果仍需进一步增大样品数进行比较分析。本研究结果可在一定程度上反映中国4省（区）的橡胶炭疽菌对咪鲜胺的敏感性情况。目前中国橡胶炭疽菌对咪鲜胺仍具有较高的敏感性，但菌株间敏感性有一定的差异，存在一定的潜在抗药性风险。

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