不同提取方法测定桑叶黄酮和多糖的含量

贾福怀 黄贝梅 涂宏建 陶刚 涂建飞

摘要[目的]通过不同提取方法测定桑叶中黄酮和多糖的含量，探讨最佳提取方法。[方法]分别采用超声波提取法、碱水提取法和煎煮法3种方法提取桑叶中多糖和黄酮，利用分光光度计法测定桑叶中多糖和黄酮的含量。[结果]超声波法测得黄酮含量最高，为1.702%；煎煮法测得多糖含量最高，为2.437%；碱水法测得黄酮和多糖均为3种方法最低的。[结论]利用不同提取方法，桑叶中黄酮和多糖测定结果差异较大，黄酮测定用超声波法效果最佳，多糖测定用煎煮法效果最佳。

关键词桑叶；提取方法；黄酮；多糖；含量

中图分类号S789.4文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）10-0124-02

Different Extraction Methods for Determining the Contents of Flavonoid and Polysaccharide in Mulberry Leaves

JIA Fuhuai，HUANG Beimei*，TU Hongjian et al（Ningbo Yufangtang Biological Technology Co.，Ltd，Ningbo，Zhejiang 315012）

Abstract[Objective] The research aimed to determine the contents of flavonoid and polysaccharide in mulberry leaves by different extraction methods，and discuss the optimum extraction methods.[Method] Polysaccharide and flavonoid in mulberry leaves were extracted by ultrasonic extraction，alkaline extraction and decoction respectively.The contents of polysaccharide and flavonoid in mulberry leaves were determined by spectrophotometer.[Result] The content of flavonoid was the highest by ultrasonic method，1.702%.The content of polysaccharide was the highest by decoction，2.437%.The flavonoid and polysaccharide were the lowest by alkaline extraction in three methods.[Conclusion] Using different extraction methods，the results of determination of flavonoid and polysaccharide in mulberry leaves are quite different.Determination of flavonoid by ultrasonic method is the best and polysaccharide determination by decoction is the best.

Key words Mulberry leaf；Extraction method；Flavonoid；Polysac

桑葉（Mulberry Leaf）别名铁扇子、家桑、黄桑叶等，为桑科（Moraceae）植物桑（Morus alba L.）的干燥叶。桑属植物全球约有16种，分布于北温带、亚洲热带和非洲热带及美洲地区。桑叶是蚕的主要食物，我国约有11种，南北各地广泛种植，以江浙一带等南方养蚕地区种植较广[1]。

桑叶药用价值广，近年来多位学者对桑叶进行研究，发现桑叶中含有黄酮类、生物碱、植物甾醇等物质，且多糖、氨基酸、维生素等含量丰富[2]。桑叶中多糖作为生物活性物质，具有显著的降血糖、抑制血脂升高、抗凝血的作用[3-4]，且能增强机体免疫力[5-6]和抗氧化能力[7-8]。黄酮的功效是多方面的，它是一种很强的抗氧剂，可有效清除体内的氧自由基，抗氧化作用可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症的发生[9]。该研究采用超声波提取法、碱水提取法和煎煮法3种方法提取桑叶中多糖和黄酮，利用分光光度计法测定桑叶中多糖和黄酮的含量，以确定提取多糖和黄酮的良好制备工艺，为工业生产桑叶多糖和黄酮提供依据，便于桑叶资源的开发利用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试材。桑叶由陕西瑞康生物科技有限公司提供，经鉴定为植物桑的干燥叶。

1.1.2仪器。NH-250DB型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司），AMCH-C20-H（予华60 W）型旋转蒸发仪（上海予华仪器设备有限公司），752紫外-可见光分光光度计（上海光谱仪器有限公司），ME204/02型分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]，TDZ4A-WA型离心机（湖南赛特湘仪离心机有限公司），HH-4型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），DHG-9140A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.1.3试剂。芦丁标准品来自上海康朗生物科技有限公司；葡萄糖来自中国食品药品检定研究院；乙醇、氢氧化钙、浓硫酸、苯酚、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠等试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1多糖和黄酮的提取。

1.2.1.1超声波法。

精确称取干燥的桑叶粗粉50 g，加入85%乙醇超声提取3次，每次1 h，过滤，合并提取液，用85%乙醇定容，即为桑叶黄酮的供试样品液A。将残渣的乙醇挥干后，用水超声提取3次，每次30 min，合并3次滤液，定容，即获得多糖的供试样品液B。

1.2.1.2碱水法。

精确称取干燥的桑叶粗粉50 g，按20倍料液比加入pH为8的碱性Ca（OH）2溶液提取剂，浸泡24 h，超声波提取2 h，过滤，残渣用相应的提取剂洗涤，合并滤液，定容，离心沉淀20 min，上清液即为桑叶黄酮的供试样品液C。精确称取干燥的桑叶粗粉50 g，

按20倍料液比加入pH为8的碱性Ca（OH）2溶液提取剂，煎煮3 次，每次2 h，滤过，合并滤液，减压浓缩，用95%乙醇过夜沉淀，取出后4 000 r/min离心分离15 min，弃去上清液，残渣用水溶解，定容，即获得多糖的供试样品液D。

1.2.1.3煎煮法。

精确称取2份干燥的桑叶粗粉各50 g，20倍重量蒸馏水，沸水浴提取3次，每次2 h，合并3次滤液，减压浓缩，其中一份为黄酮供试样品液E，另一份加入10%三氯乙酸，静置，离心，弃去沉淀继续浓缩至一定体积，用95%乙醇过夜沉淀，取出后4 000 r/min离心分离15 min，弃去上清液，残渣用水溶解，定容，即获得多糖的供试样品液F。

1.2.2标准品溶液的制备。

1.2.2.1芦丁标准品溶液的制备。芦丁标准品于120 ℃干燥至恒重，准确称取15 mg，用60%乙醇溶解，置于100 mL容量瓶并定容，制成0.15 mg/mL的芦丁标准品溶液。

1.2.2.2葡萄糖标准品溶液的制备。葡萄糖标准品于105 ℃干燥至恒重，准确称取50 mg加水溶解，50 mL容量瓶中定容，摇匀，即得葡萄糖标准品溶液。

1.2.3标准曲线的绘制。

1.2.3.1黄酮标准曲线的绘制。分别取芦丁标准品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠0.4 mL，放置6 min，加10%硝酸铝0.4 mL，放置6 min，加4%氢氧化钠4 mL，定容，摇匀，放置15 min，在510 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标、总黄酮含量为横坐标绘制标准曲线（图1），得回归方程 Y=5.507 1X-0.004 2（R2=0.999 6）。

1.2.3.2葡萄糖标准曲线的绘制。分别取葡萄糖标准品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，各取1.0 mL于10 mL比色管中，分别加入5%苯酚溶液1.0 mL，加入5.0 mL浓硫酸，立即摇匀，沸水浴加热10 min，冰水冷却至室温，在485 nm处测吸光度。以吸光度为纵坐标、葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线（图2），得回归方程Y=11.275 1X+0.004 6（R2=0.998 9）。

1.2.4样品含量的测定。

1.2.4.1黄酮含量测定。准确移取黄酮供试样品液1.0 mL，置于25 mL容量瓶，用85%乙醇定容，再取2.0 mL定容至10 mL，用硝酸铝显色法显色，测定吸光度，计算黄酮的含量。

1.2.4.2多糖含量测定。准确移取多糖供试样品液1.0 mL，置于25 mL容量瓶，用蒸馏水定容，用“1.2.3.2”方法测定吸光度，计算多糖的含量。

2结果与分析

从表1可以看出，超声波法、碱水法、煎煮法3种方法提取黄酮和多糖时，超声波法测得黄酮含量最高，为1.702%；煎煮法测得多糖含量最高，为2.437%；碱水法测得黄酮和多糖均为3种方法最低的，分别为0.846%和1.142%。张强等[10]利用超声波法、索氏提取法、水煮法测桑叶黄酮和多糖得率，超声波法均为最高，该试验黄酮得率结果与此一致，但多糖含量结果与此存在差异，有待于进一步研究。陆广富等[11]用水煮法，采取正交试验得出，当加水量为25倍，煎煮时间2 h，煎煮3次为桑叶多糖水提最佳工艺，该试验采用20倍重量蒸馏水，沸水浴提取3次，每次2 h，在加水量上有所减少。而Samavati等[12]得出提取温度越高、煎煮时间越长多糖得率越高的结论。薛淑萍等[13]在优化桑叶中黄酮类化合物的提取工艺时认为，超声波法提取黄酮时间虽短，但所需溶剂量大，前期投入大，对设备的要求高，工业化大生产存在一定困难。实验室理论研究与工业化大生产存在差异，试验结果的应用与推广还需要在工业生产中进一步验证。

3结论

采用超声波提取法、碱水提取法和煎煮法3种方法提取桑叶中多糖和黄酮，利用分光光度计法测定桑叶中多糖和黄酮的含量。结果表明，超声波法测得黄酮含量最高，为1.702%；煎煮法测得多糖含量最高，为2.437%；碱水法测得黄酮和多糖均为3种方法最低的。利用不同提取方法，桑叶中黄酮和多糖测定结果差异较大，黄酮测定用超声波法效果最佳，多糖测定用煎煮法效果最佳。实验室理论研究与工业化大生产存在差异，试验结果的应用与推广还需要在工业生产中进一步验证。

参考文献

[1]

江苏新医学院.中药大辞典（下册） [M].上海：上海科学技术出版社，1986.

[2] 邹盛勤，陈武.桑叶的化学成分、药理活性及应用研究进展[J].林产化工通讯，2003，37（1）：22-25.

[3] HOSSEINZADEH H，SADEGHI A.Antihyperglycemic effects of Morus nigra and Morus alba in mice[J].Pharm Pharmacol Lett，1999，9（2）：63-65.

[4] 包立軍，张剑韵，黄龙全.桑叶中抗凝血活性成分的初步分离与纯化[J].蚕业科学，2006，32（2）：418-421.

[5] 周启升，刘训理，段祖安.植物多糖的研究与开发应用进展[J].蚕业科学，2010，36（3）： 465-469.

[6] 侯瑞宏，廖森泰，刘凡，等.桑叶多糖对小鼠免疫调节作用的影响[J].食品科学，2011，32（13）：280-283.