党参毛状根诱导条件研究

薛雯心 刘立业 袁金月 刘琪 魏铁锁 郑彦杰 李秀霞

摘要[目的]研究党参毛状根的诱导条件。[方法]利用发根农杆菌A4、C58C1和A1476进行毛状根诱导，探讨发根农杆菌种类、外植体类型、菌液浓度、侵染时间和共培养天数等因素对党参毛状根诱导的影响。[结果]3种发根农杆菌中A4诱导率最高；茎段的诱导率最高；发根农杆菌浓度在OD600为0.4时诱导效果较好；较佳侵染时间为5 min；共培养时间为2 d时诱导率较高；头孢噻肟钠浓度为300 mg/L时除菌效果较好。[结论]该试验为大量生产毛状根以及毛状根的后续研究提供试验基础。

关键词党参；毛状根；诱导条件；发根农杆菌

中图分类号S567.5+3文献标识码A文章编号0517-6611（2017）10-0121-03

Study on the Induction Condition of Hairy Roots of Codonopsis pilosula

XUE Wenxin，LIU Liye，YUAN Jinyue，LI Xiuxia* et al

（College of Life Science， Jiamusi University， Jiamusi，Heilongjiang 154007）

Abstract[Objective] The research aimed to study the induction condition of hairy roots of Codonopsis pilosula.[Method] The hairy roots were induced by Agrobacterium rhizogenes strains of A4， C58C1 and A1476，the effects of Agrobacterium rhizogenes species， explants types， concentration of bacterium，infection time， cocultivation period on hairy roots inductivity of Codonopsis pilosula were discussed.[Result] Among the three Agrobacterium rhizogenes，the induction rate of A4 was the highest.The induction rate of stem was the highest.The inductivity at OD600 0.4 was better performing.Better infection time was five minutes.The inductivity was higher when the time of cocultivation was two days. When the concentration of cefotaxime sodium was 300 mg/L， the sterilization effect was better.[Conclusion] This test provides experimental basis for the mass production of hairy roots and followup study of the hairy roots.

Key wordsCodonopsis pilosula；Hairy roots；Inducement condition；Agrobacterium rhizogenes

党参[Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.]属桔梗科植物[1]，多年生草质藤本，以干燥根入药[2]，为我国常用大宗药材之一[3]。我国是党参属药材的主要产区和资源分布中心，全世界有党参属植物40 多种，我国就有39 种之多[4]，主产于山西、陕西、甘肃等地[5]。几十年来，在原有研究基础上，国内外对党参化学成分进行了深入研究[6]。党参属药用植物所含化学成分相似，主要有聚炔类、萜及三萜皂苷类、苯丙素类、兹醇、生物碱、倍半萜内酯、香豆素等多种类型的化学成分。从党参中还分离得到多糖类、甾类、挥发油成分、多种氨基酸和微量元素[7]。

现代药理研究表明，党参具有调节血糖、促进造血、降压、抗缺氧、耐疲劳、增强机体免疫力、调节胃肠收缩及抗溃疡等多重作用[8]，并常作为人参的替代品[9]。

发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）是一种根瘤菌科的革兰氏阴性菌[10]，其侵染植物后，会使植物产生大量的不定根，这些不定根不断分支，表现出毛状，称之为毛状根（Hairy Roots）[11]。毛状根具有遗传性能稳定、生长速度快、能够合成该植物特征的次生代谢产物等特点。到1982年才报道发根农杆菌侵染植物产生发状根的机理，现已获得了300多种植物的毛状根体系[12]，如王不留行[13]、南药巴戟天[14]、太子参[15]、新疆紫草[16]等均有研究报道。毛状根生产药用植物有效成分已经显示出较好的应用潜力，必将带来可观的社会效益和经济效益。因此，研究党参毛状根诱导及后续的大量培养等问题具有重要意义和广阔的应用发展前景。笔者利用发根农杆菌A4、C58C1和A1476进行毛狀根诱导，探讨发根农杆菌种类、外植体类型、菌液浓度、侵染时间和共培养天数等因素对党参毛状根诱导的影响。

1材料与方法

1.1材料

外植体取自佳木斯大学生命科学学院实验室培育的党参无菌苗，发根农杆菌A4、C58C1和 A1476由佳木斯大学生命科学学院经济植物研究所提供。 预培养培养基：MS，pH 5.8；共培养培养基：1/2MS+乙酰丁香酮（AS，100 mg/L）；除菌培养基：MS+300 mg/L头孢噻肟钠，pH 5.8；菌种活化培养基：YEB培养基，pH 7.0；毛状根继代培养基：1/2MS，pH 5.8。

1.2设备

752N凌光紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司制造）；

DZTW调温电热套（北京市永光明医疗仪器有限公司）；

恒温振荡器（中外合资深圳天南海北有限公司）；

150G振荡培养箱（江蘇省金坛市荣华仪器制造有限公司）；

SPX-250B-G型光照培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；

JA1003电子天平（上海舜宁恒平科学仪器有限公司）；

SZ-97自动三重水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）。

1.3试验方法

1.3.1无菌苗的培养。

将种子去掉边缘种翅，在自来水下冲洗30 min，75%乙醇消毒20 s，2%次氯酸钠溶液灭菌20 min，无菌水清洗5～6次，用无菌滤纸吸去多余水分，然后在无菌工作台上接种到MS培养基中，最后放在培养室内进行培养，培养温度为（25±1）℃，光照强度2 000～2 500 lx，光照时间12 h/d。

1.3.2菌种的活化。

挑取保存在-80 ℃灭菌甘油中的发根农杆菌菌株A4、C58C1和A1476，于YEB固体培养基上活化培养后，转接到YEB液体培养基中，28 ℃、160 r/min振荡暗培养。将处于对数生长期的菌液用于接种感染党参外植体。

1.3.3外植体的转化方法。

1.3.3.1外植体的预培养。

选取生长健壮的无菌苗，在超净工作台上，将党参叶片切成0.5 cm2的小块，叶柄和茎段切成长为0.5 cm的小段，接种于MS培养基中，（25±1）℃暗处培养2 d。

1.3.3.2侵染与共培养。

将外植体浸入已活化好的菌液中5 min，侵染结束后取出外植体，先用无菌滤纸吸干菌液，然后接种到含乙酰丁香酮（100 μmol/L）的固体1/2MS培养基上，黑暗条件下培养2 d。

1.3.3.3

毛状根诱导及除菌培养。

共培养后，将外植体用无菌水清洗5次，用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，然后转接至含有300 mg/L头孢噻肟钠的除菌培养基上进行除菌培养，每隔7 d继代1次，经反复除菌至培养基看不到菌斑。将长到2 cm左右的毛状根剪下，转入到含有IAA（1.0 mg/L）的1/2MS培养基上进行继代培养。

1.3.4各试验条件梯度的设置。

试验所用发根农杆菌种类为A4、C58C1和A1476；外植体的种类为茎段、叶片、叶柄；菌液浓度OD600的值设置为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8；侵染时间设置为5、10、20、30 min；共培养时间设置为1、2、3、4、5 d；头孢噻肟钠浓度设置为200、300、400、500 mg/L。

2结果与分析

2.1不同菌种的发根农杆菌对党参毛状根诱导率的影响

试验结果表明（表1），A4和C58C1这2种菌株均能诱导出毛状根，发根农杆菌A1476没有成功诱导出毛状根。A4和C58C1菌株对党参叶片的诱导率分别为56%和16%，可见A4和C58C1这2种菌株对党参毛状根的诱导能力有显著的差别（图1），A4的诱导能力明显大于C58C1。

表2.2不同外植体对党参毛状根诱导率的影响

以A4菌株作为试验菌株，结果表明（表2），外植体的类型对党参毛状根的诱导率存在一定影响，在除菌培养基中褐化最严重的是叶柄，叶片其次，茎段相对较好。茎段的毛状根诱导率为48%，诱导率高，生根早；叶片诱导率次之，为30%；叶柄诱导率最低，为4%。通过A4菌液的侵染，茎段、叶片和叶柄都可以长出毛状根，但不同类型的受体每一外植体生根的长度和数量也是不同的。因此，茎段为诱导毛状根的最佳外植体。

2.3菌液浓度对党参毛状根诱导率的影响

以A4菌株作为试验菌株，结果表明（表3），菌液浓度不同毛状根的诱导率也不同。菌液浓度过高或过低均不利于提升转化频率，菌液浓度OD600为0.1～0.8，毛状根的诱导率随着菌液浓度的增加出现先增加后减小的趋势。在菌液浓度OD600为0.4时，毛状根的诱导率最高，为52%。当菌液浓度OD600为0.8时，由于菌液浓度过高，导致外植体褐化严重，部分外植体已丧失生根能力。因此，诱导毛状根的最佳菌液浓度OD600是0.4。

2.4侵染时间对党参毛状根诱导率的影响

由表4可知，侵染时间的长短对党参毛状根的诱导率有一定的影响，随着侵染时间的延长，诱导率反而降低。其中侵染时间为5 min时，诱导率最高，为54%；当侵染时间为10 min时，诱导率为18%，与侵染5 min的诱导率差别较大，诱导率的降低是因为侵染时间过长使后期菌株生长迅速，造成除菌困难；当侵染时间为20 min时，多数外植体失去生命力而丧失诱发毛状根的能力；当侵染时间为30 min时，外植体褐化非常严重，24 h后已完全丧失生命力，生根率为0。表明当侵染时间为5 min时侵染的效果最佳。

2.5侵染后共培养时间对党参毛状根诱导率的影响

以A4菌株作为试验菌株，结果表明（表5），共培养时间对党参毛状根的诱导率有显著的影响。共培养时间为2 d时，诱导率最高，为50%；共培养时间为1和3 d时诱导率相差不大，分别为36%和38%；共培养时间为4 d时，诱导率下降，为22%；当共培养时间为5 d时，由于共培养时间过长，外植体周围长满了农杆菌，造成除菌困难，诱导率仅为2%。因此，诱导毛状根的最佳共培养时间为2 d。

3小结与讨论

不同的植物对不同发根农杆菌的敏感程度是不同的。该试验选取了A4、C58C1和A1476 3种发根农杆菌作为侵染菌种，试验结果表明，3种发根农杆菌仅A4和C58C1能使党参诱导出毛状根，其中A4诱导率较高。说明不同菌株具有不同的致根能力，可能是A4和C58C1对党参比较敏感。

选择合适的外植体是建立诱导体系的重要任务，以往研究表明，子叶、茎、叶及果实是使用较多的外植体，不同的植物最适外植体也存在较明显的差异[17]。此试验选取了党参幼苗的茎段、叶片和叶柄作为转化材料。试验中观察到，用茎段作为感染材料诱导率最高，叶片的诱导率其次，叶柄的诱导率最低。因此，茎段为诱导毛状根的最佳外植体。

菌液浓度对党参毛状根的诱导率有一定的影响。菌液浓度OD600为0.1～0.3时，诱导率随浓度呈正相关，菌液浓度OD600为0.8时，伤口处的细胞褐化非常严重，很快就失去了生命力。试验结果表明，菌液浓度以OD600为0.4诱导率最高。除了菌液浓度之外，侵染时间也影响毛状根的诱导率。在5 min时诱导率最高，10～20 min诱导率逐渐降低，30 min时生根率为0，因为侵染时间过长使后期菌株生长迅速，造成除菌困难，多数外植体失去生命力而丧失诱发毛状根的能力。表明诱导毛状根最佳的侵染时间为5 min。

共培养时间是一个重要的因素。共培养时间过长时，外植体周围长满了农杆菌，造成除菌困难，最终导致外植体褐化严重而丧失生根能力。如果共培养时间不足，则不能完成T-DNA转移与整合，毛状根的转化不能实现。因此，较适宜的共培养时间为2 d，这样既有效地提高了转化率又不会让农杆菌大量繁殖，而且毛状根多分枝，生长十分旺盛。

试验结果表明，在除菌培养基中添加不同浓度的头孢噻肟钠对党参毛状根的诱导率有显著的影响。合适的头孢噻肟钠浓度不仅能起到很好的抑菌效果，而且对毛状根的生长影响也较小。当头孢噻肟钠浓度为200 mg/L时，培养基上有菌落出现；当头孢噻肟钠浓度为500 mg/L时，毛状根完全不能生长；当头孢噻肟钠浓度为300 mg/L时，毛状根的生长情况最好。因此，选择300 mg/L头孢噻肟钠作为除菌培养基更合适。

45卷10期薛雯心等党参毛状根诱导条件研究

参考文献

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