浓缩型兽用双黄连口服液的急性毒性及亚慢性毒性试验

吴苑滢　宋漫玲　谷俐嫒　杨剑　韦英益　胡庭俊

摘要：[目的]评价浓缩型兽用双黄连口服液的用药安全性，为其临床用药提供参考依据。[方法]以昆明系小鼠为试验对象，通过开展浓缩型兽用双黄连口服液的急性毒性及亚慢性毒性试验，确定其临床应用的主要毒性作用及毒性作用靶器官。其中，急性毒性试验设20.00、10.00、5.00、2.50和1.25g/kg5个剂量组，试验开始当天在24h内分2-3次对小鼠进行灌胃给药；最大耐受量试验用药剂量为240.00g/kg，试验开始当天在24h内分2次对小鼠进行灌胃给药，每次0.80mL/只；亚慢性毒性试验设每天灌服0.16、0.08和0.04mL/只3个剂量组，连续灌胃给药28d。[结果]急性毒性试验小鼠灌胃给药后30min内精神萎靡，安静，呼吸变慢，但30mind恢复正常，未出现中毒症状和死亡现象，未能测出半数致死量（LD₅₀）。小鼠对浓缩型兽用双黄连口服液的最大耐受量大于240.00g/kg。亚慢性毒性试验期间，各用药组小鼠的体重、脏器（肝脏、脾脏和。肾脏）指数和血清学指标（谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮和肌酐含量）与空白对照组相比均无显著差异（P>0.05）；病理组织切片观察发现，仅高剂量组小鼠的肝脏有损伤，肝细胞有点状坏死灶，肝细胞索凌乱，细胞界限模糊不清，细胞核着色减弱，其他脏器组织切片均无异常变化。[结论]浓缩型兽用双黄连口服液对小鼠无急性毒性作用，长期连续用药也无亚慢性毒性作用，安全性较高。

关键词：小鼠；浓缩型兽用双黄连口服液；急性毒性；最大耐受量；亚慢性毒性

中图分类号：S853.74 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）11-2086-06

0引言

[研究意义]双黄连是由金银花、黄芩、连翘三味中药精制而成的方剂，其主要功效是辛凉解表、清热解毒（张志美等，2010；刘刚和赵华，2013）。《中国兽药典》规定：双黄连口服可用于治疗猫、犬和鸡等动物的感冒发热。现代药理学也研究证实，双黄连具有抗病毒、抗菌抗炎和增强机体免疫力等多重功效。目前市面上已有的兽用双黄连制剂包括口服液、注射液、颗粒剂、散剂和粉剂等（杨海涵等，2009），但随着双黄连在兽医临床上的推广应用，上述制剂品种已无法满足多样化和个性化的临床需求。因此，加强兽用双黄连新剂型的研发对满足各种临床需求及促进其推广应用具有重要意义。[前人研究进展]至今，有关双黄连制剂在兽医临床上的应用已有较多报道。汪勇等（2006）通过母畜子宫内膜炎临床治疗试验，发现双黄连注射液对家畜无毒副作用，且能增强家畜抵抗力，是治疗母畜子宫内膜炎的首选药物。周翠珍等（2008）以不同剂量双黄连可溶性粉剂对人工感染的鸡传染性支气管炎进行预防和治疗，结果表明，双黄连可溶性粉剂防治鸡传染性支气管炎的效果显著。徐海瑛等（2012）研究表明，双黄连口服液和青霉素G联用对金黄色葡萄球菌的抑菌浓度指数（FIC）为0.125，二者对金黄色葡萄球菌的联合药敏结果呈协同作用。赵增成等（2014）通过对比9种中药方剂对鸡大肠杆菌病的防治效果，发现双黄连口服液无论在体外或体内对大肠杆菌均具有一定的防治效果。关于双黄连制剂的毒理学研究，解黎雯等（1999）研究表明，给小白鼠灌服双黄连口服液的剂量达225g/kg时，小白鼠全部健康存活，且对体重、血液生化指标和主要脏器系数均无显著影响；周德刚等（2011）通过急性毒性试验证实，双黄连口服液对小白鼠的最小致死量范围为49.2～60.8g/b，相当于禽类临床用量的111.8～138.2倍，即临床应用具有一定安全性；贺一新等（2017）研究证实，双黄连口服液（仅适用于儿童）浓缩膏对幼年大鼠全身脏器和组织无相关毒性作用，安全性较好。[本研究切入点]浓缩型兽用双黄连口服液是本课题组针对鸡风热感冒研制而成，临床用药试验证实给药后3～5d病鸡精神状态明显好转且咳嗽减少，给药后11d病鸡各方面逐渐恢复正常，治疗效果明显，但目前关于浓缩型兽用双黄连口服液的毒理学研究尚无文献报道。[拟解决的关键问题]通过开展浓缩型兽用双黄连口服液的急性毒性及亚慢性毒性試验，确定其临床应用的主要毒性作用及毒性作用靶器官，并评价用药安全性，为浓缩型兽用双黄连口服液的临床用药提供参考依据。

1材料与方法

1.1试验材料

浓缩型兽用双黄连口服液为河南牧翔动物药业有限公司的中试产品（100mL/瓶），生产批号20140208，规格3.0g/mL；谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐检测试剂盒购自南京建成生物科技有限公司；昆明系小鼠（15.00～22.00g/只）购自广西医科大学实验动物中心，雌雄各半。主要仪器设备有AidaTD-5A台式低速离心机、CD-UPT-1纯水仪、AB104-L分析天平（瑞士梅特勒）、ALPHARA-8旋转蒸发仪、UV-1800型紫外可见分光光度计、DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅和尼康YS100生物显微镜等。

1.2急性毒性试验

首先进行预试验，将20只小鼠随机分成5组，每组4只，分笼饲养。浓缩型兽用双黄连口服液设A（20.00g/kg）、B（10.00g/kg）、C（5.00g/kg）、D（2.50g/kg）和E（1.25g/kg）5个剂量组，于试验开始当天在24h内分2～3次对小鼠进行灌胃给药。连续观察7d，详细记录小鼠的饮食、饮水变化及有无中毒或死亡现象出现。给药第8d将全部供试小鼠颈椎脱臼处死，解剖观察其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃和肠道等器官有无异常变化。若预试验有小鼠死亡，则按死亡组给药剂量估计死亡率靠近0和100%的剂量范围，为急性毒性试验的正式试验提供依据。若预试验无小鼠死亡，则需进行药物的最大耐受量试验。采用寇氏法计算供试药物的半数致死量（LD₅₀）及95%可信限范围。

1.3最大耐受量试验

随机挑选20只小鼠（小鼠给药体重均按20.00g/只计），给药剂量240.00g/kg，于试验开始当天在24h内分2次对小鼠进行灌胃给药，每次0.80mL/只。给药后24h内观察小鼠是否发生中毒反应，随后每日观察小鼠的饮食、精神状态、自主活动、粪便情况等1～2次，并做好记录。连续观察7d，试验期间保持各饲养管理条件一致。给药第8d将全部供试小鼠颈椎脱臼处死，解剖观察其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃和肠道等器官有无异常变化。

1.4亚慢性毒性试验

将80只小鼠随机分为4组，每组20只（雌雄各半），分笼饲养，每笼10只。根据急性毒性试验和最大耐受量试验结果分别设空白对照组及高剂量组（24.00g/kg）、中剂量组（12.00g/kg）和低剂量组（6.00g/kg）。高剂量组小鼠每天灌胃给药0.16mL/只，中剂量组小鼠每天灌胃给药0.08mL/只，低剂量组小鼠每天灌胃给药0.04mL/只；空白对照组小鼠自由饮水。连续用药28d。每日观察小鼠的一般健康状态，包含采食与饮水、活动、发病及死亡情况等。第1次给药前称重，此后每7d称重一次，共5次。第29路组小鼠称重、眼眶采血后颈椎脱臼处死，对处死小鼠进行全面检查，采集其肝脏、脾脏和肾脏称重并记录，计算肝脏、脾脏和肾脏指数。脏器指数=脏器重（mg）/体重（g）。经小鼠眼眶采集的血液先进行白细胞总数计数（n=80），同时离心收集血清，-20℃保存或按相关检测试剂盒说明测定小鼠血清中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮和肌酐含量。采集的肝脏、脾脏和肾脏称重后，以10%中性福尔马林固定，用于制作组织切片。

1-.5统计分析

试验数据采用SPSS16.0进行方差分析和多重比较。

2结果与分析

2.1急性毒性试验结果

急性毒性试验观察发现，灌胃给药后30min内小鼠精神萎靡，安静，呼吸变慢，30min后精神状态恢复正常，可采食饮水；24h内小鼠未出现中毒症状。连续观察7d，所有小鼠的食欲、精神状态及采食、饮水、排便等活动正常，无中毒症状和死亡现象出现。经剖检观察发现，小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、胃、肠道等主要脏器无异常变化。因无小鼠死亡，未能计算出浓缩型兽用双黄连口服液的LD₅₀，而需进行最大耐受量试验以检验药物安全性。

由表1可看出，灌服不同剂量浓缩型兽用双黄连口服液后，小鼠的体重均有所增长，但各剂量组间差异不显著（P>0.05，下同）；各剂量组小鼠的平均增重范围为4.57～6.19g/只，增重率为21.42%～29.01%，组间差异均不显著。

2.2最大耐受量试验结果

在最大耐受量试验期间，小鼠也未出现死亡现象。临床观察发现，灌胃给药后30min内小鼠精神萎靡，不愿动，呼吸变慢，30min后精神状态恢复正常，可采食饮水；24h内小鼠未出现中毒症状。连续观察7d，均无中毒症状和死亡现象出现，所有小鼠的食欲、精神状态及采食、饮水、排便等活动正常。给药后第8d剖检观察发现，小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、胃、肠道等脏器均未出现任何肉眼可见的特征性病理变化。在体重增重方面，小鼠平均增重2.92g/只，增重率为13.45%。根据药物毒理学评价标准判定，当药物LD₅₀>5g/kg时，该药物属于实际无毒性物质。本研究中，浓缩型兽用双黄连口服液的最大耐受量试验口服剂量达240.00g/kg，小鼠仍健康存活，表明浓缩型兽用双黄连口服液对小鼠的安全性很高。

2.3亚慢性毒性试验

2.3.1临床表现 在亚慢性毒性试验期间，3个药物剂量组小鼠活动自如，排泄物无异常，正常饮食，未见异常行为，也未出现死亡现象。在体重增重方面，3个用药组小鼠的体重变化趋势与空白对照组基本一致，各处理组间均无显著差异（图1）。

2.3.2脏器指数 剖检观察发现，各处理组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的形态、颜色、质地均正常，无明显的肉眼可见病变。中、高剂量组小鼠的肝脏指数、脾脏指数和肾脏指数略高于空白对照组（表2），但差异不显著，说明经胃灌服浓缩型兽用双黄连口服液不会导致小鼠实质脏器损伤或异常变化。

2.3.3血清生化指标 连续给药28d后，小鼠血清中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮和肌酐含量随给药剂量的增加呈逐渐上升趋势，但与空白对照组相比差异均不显著（表3）；白细胞计数结果也表明，高、中、低剂量组小鼠的白细胞数与空白对照组相比差异均不显著。说明经胃灌服浓缩型兽用双黄连口服液对小鼠的白细胞及肝脏、肾脏功能均未产生明显影响。 2.3.4脏器组织形态结构 取各处理组小鼠的肝脏、脾脏和肾脏制作病理组织切片，经HE染色后，显微镜下观察发现，高剂量组小鼠的肝脏有损伤，肝细胞有点状坏死灶，肝细胞索凌乱，细胞界限模糊不清，细胞核着色减弱（图2和图3）；中、低剂量组小鼠的肝脏组织切片未见异常病理变化。各处理组小鼠肾脏组织切片中肾小管、肾小球轮廓清晰可辨，无颗粒变性或明显的炎症变化；脾脏组织切片中红髓、白髓和脾小体清晰，也无明显的病理变化。说明长期灌服浓缩型兽用双黄连口服液的用药剂量达24.00g/kg时，会影响小鼠肝脏组织形态结构，即肝细胞受到一定程度的损伤。

3討论

双黄连具有抗病毒、抗菌、抗炎症、调节免疫等多重功效（程慧等，2011；刘刚和赵华，2013），尤其对乙型链球菌、藤黄微球菌、大肠杆菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等有很强的杀菌或抑菌作用（杨海涵等，2009），在临床上多用于治疗呼吸、消化和泌尿系统疾病，且疗效显著（董文刚，2010）。本研究结果表明，经胃灌服浓缩型兽用双黄连口服液的小鼠生长发育良好，无论是雌性还是雄性，其体重均能保持稳定的增长趋势，与空白对照组相比无显著差异；连续给药28d后，小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的形态、颜色和质地均正常，无明显的肉眼可见病变，其肝脏指数、脾脏指数和肾脏指数与空白对照组的差异也不显著。血液白细胞数量增加通常见于感染、应激（手术、创伤等）和急性慢性白血病等。本研究的亚慢性毒性试验结果表明，高、中、低剂量组小鼠的白细胞数与空白对照组相比差异不显著，进一步说明浓缩型兽用双黄连口服液对小鼠的安全性很高。

谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮和肌酐4项血清学生化指标在兽医毒理学研究中主要用于测定肝胆肾功能。谷丙转氨酶又称谷氨酸转氨酶或丙氨酸氨基转移酶，其含量升高可能预示着肝脏发生异常变化，如肝损伤和各类肝炎等。本研究通过检测谷丙转氨酶含量能了解浓缩型兽用双黄连口服液对小鼠肝脏的损伤情况。谷草转氨酶也是预示肝功能异常的指标，且与动物体内的蛋白代谢密切相关。当机体肝脏损伤必然导致血清中的谷丙转氨酶和谷草转氨酶上升（吕琼霞等，2011）。肌酐分为血清肌酐和尿肌酐，是评价肾功能的主要指标之一（李海霞等，2006）。血清肌酐含量较高时表明肾功能出现问题，肾脏代谢能力降低，致使某些有害毒素无法正常排出体外。肾功能受损时常见尿素氮等指标上升，因此尿素氮也是评价肾小球滤过的主要指标之一（万贞元等，2014）。本研究的亚慢性毒性试验结果显示，连续给药28d后，各剂量组小鼠血清中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐含量与空白对照组相比差异均不显著，表明浓缩型兽用双黄连口服液对小鼠的肝脏、肾脏功能无不良影响。

本研究还采集小鼠的肝脏、脾脏和肾脏制作病理组织切片，经HE染色后，显微镜下观察发现仅高剂量组小鼠的肝脏有损伤，肝细胞有点状坏死灶，肝细胞索凌乱，细胞界限模糊不清，细胞核着色减弱，其他脏器组织切片均无异常变化，其原因可能是长期灌服高剂量（24.00g/kg）浓缩型兽用双黄连口服液会对小鼠肝脏细胞造成轻微损伤。但综合其他试验结果，认为浓缩型兽用双黄连口服液对小鼠仍具有较高的安全性。

4结论

浓缩型兽用双黄连口服液对小鼠无急性毒性作用，长期连续用药也无亚慢性毒性作用，安全性较高。

（责任编辑兰宗宝）