褐纹报春苣苔组织培养与快速繁殖

闫海霞　邓杰玲　黄昌艳　关世凯　何荆洲　张自斌　卜朝阳

摘要： 褐纹报春苣苔（Primulina glandaceistriata）是一种极具观赏价值的喀斯特地区野生花卉，目前尚未有褐纹报春苣苔组培快繁的研究报道。该研究以褐纹报春苣苔的叶片为外植体，通过两种途径建立其组培快繁体系。结果表明：适宜的不定芽诱导培养基为MS+6BA 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1，适宜的不定芽增殖培养基为MS+ZT 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1+活性炭 0.05 g·L1，增殖系数为11.09；适宜的愈伤组织诱导培养基为MS+TDZ 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1，适宜的愈伤组织分化培养基为MS+ZT 1.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1，分化系数为12.46；适宜的生根培养基为1/2MS+IBA 0.1 mg·L1+活性炭0.05 g·L1或1/2MS+IBA 0.5 mg·L1+活性炭0.05 g·L1，生根率为100%。该研究结果成功建立了褐纹报春苣苔的组培快繁体系，为今后褐纹报春苣苔的种苗繁殖和遗传转化提供了技术支持。

关键词： 苦苣苔， 褐纹报春苣苔， 组织培养， 不定芽， 愈伤组织

中图分类号： Q943.1

文献标识码： A

文章编号： 10003142（2017）10127009

褐纹报春苣苔（Primulina glandaceistriata）是苦苣苔科（Gesneriaceae）报春苣苔属（Primulina）的多年生草本植物，本种在广西灵川县首次发现。该种的主要特征是叶片具有棕色的条纹，花朵形态美丽，四季常绿，是极具观赏价值的喀斯特地区野生花卉。目前尚未有褐纹报春苣苔的相关研究报道，对其物种保护十分不利。褐纹报春苣苔的繁殖可以采用种子播种或叶片扦插的方法，但种子细小不易收集，采种繁琐，扦插繁殖系数小，出芽时间长，不利于人工繁殖的规模化。离体快繁具有繁殖系数大、繁殖时间短的优点，是人工繁育种苗的极佳手段，也是种质资源保存重要手段，如张占江等（2014）利用离体培养的方法对弄岗报春苣苔进行了保存。

离体快繁的途径有不定芽途径和愈伤组织诱导途径。这两种途径在苦苣苔科报春苣苔属的其他植物上已有报道，其中以不定芽途径的相关报道较多，侯娜等（2015）以荔波报春苣苔的叶片为外植体，通过不定芽途径获得了再生植株，付传明等（2015）以条叶报春苣苔的叶片为外植体，通过不定芽途径建立了其离体快繁体系，潘梅等（2014）通过不定芽途径成功建立了烟叶报春苣苔的再生繁殖体系，张占江等（2013）以条叶报春苣苔的叶片、种子为外植体，建立了条叶报春苣苔的组织培养和再生体系。尽管苦苣苔的组培研究逐年增多，但关于褐纹报春苣苔的组培研究并未见有报道。本研究以褐纹报春苣苔的叶片为材料，通过不定芽途径和愈伤组织诱导途径建立其高效稳定的组培快繁体系，为褐纹报春苣苔的物种保育和遗传转化提供理论和技术基础。

1材料与方法

1.1 材料

经人工驯化的褐纹报春苣苔成熟植株，由广西壮族自治区农业科学院花卉研究所提供。

1.2 培养基及培养条件

以MS为基本培养基，以培养目的添加不同种类和浓度的植物生长调节剂，白砂糖为30 g·L1，琼脂为6.0 g·L1，pH 5.8～6.2（生根培养用1/2MS为基本培养基，其大量元素和白砂糖为MS培养基中的1/2，其余成分的含量和MS培养基保持一致），配制分装后，于121 ℃灭菌25 min。冷却后接种，在温度（28 ± 1） ℃、光照强度2 000 lx、光照时间14～16 h·d1的条件下培养。

1.3 外植体的灭菌

春季取健康植株的幼嫩叶片，洗衣粉浸洗10 min，再在流水下冲洗0.5 h，然后转移到超净工作台进行灭菌的操作。先用棉球蘸取75%酒精溶液拭擦叶片的正反两面，无菌水冲洗5次；再将叶片在75%酒精溶液中浸泡10～12 s，无菌水冲洗5次；最后将叶片在0.1%升汞溶液中浸泡10 min，无菌水冲洗5次。灭菌过程中，轻轻震荡使叶片充分接触溶液。灭菌结束后，将叶片切成1 cm × 1 cm大小，按照叶面朝上、叶背朝下的方式平铺接入不同的培养基中（图1：A）。

1.4 不定芽诱导及增殖

1.4.1 不定芽诱导将叶片接入培养基中。每种培养基接种叶片30片，3次重复。培养30 d及60 d后，统计从叶片直接诱导出不定芽的数量，计算不定芽诱导率：不定芽诱导率=产生不定芽叶片数/接种数×100%。

1.4.2 不定芽增殖将获得的不定芽接入增殖培养基中。每种培养基接种不定芽30株，3次重复。培养30 d后计算增殖系数：增殖系数=新芽数/接种芽数。

1.5 愈伤组织诱导及分化

1.5.1 愈伤组织诱导将叶片接入培养基中。每種培养基接种叶片30片，3次重复。培养30 d及60 d后，统计从叶片直接诱导出的愈伤组织数、不定芽数以及愈伤分化出的不定芽数，计算愈伤组织诱导率。

愈伤组织诱导率=产生愈伤组织的叶片数/接种数×100%。

1.5.2 愈伤组织分化培养将获得的愈伤组织接入愈伤组织分化培养基中。每种培养基接种愈伤组织30块，3次重复。培养30 d后统计新芽分化系数。

分化系数=分化新芽数/接种数。

1.6 生根培养与炼苗移栽

将具有4片以上叶片的小苗接入生根培养基中进行生根诱导培养。每种培养基接种小苗30株，3次重复。培养30 d后统计产生根的植株数量，并对根长、根条数进行记录，计算生根率。

待植株生根后，将具有6片以上叶片、根数7条以上、根长3 cm以上的组培瓶苗放置温室中炼苗5～7 d后在温室中进行移栽，移栽基质为泥炭混合珍珠岩（体积比为2∶1），20 d后统计移栽成活率。

1.7 统计分析

采用Excel 2003软件进行统计处理，采用SPSS 19.0软件进行方差分析以及Duncans 多重比较。小写字母表示差异达到显著水平（P<0.05）。

2结果与分析

2.1 不定芽以及愈伤组织的诱导

2.1.1 不定芽的诱导从表1可以看出，在30 d的培养时间内，添加6BA的培养基可从叶片直接诱导出不定芽，但无愈伤组织形成。在相同的NAA浓度下，不定芽率及不定芽数随着6BA浓度的增加呈先上升后下降的趋势，当6BA浓度为2.0 mg·L1时，不定芽率以及不定芽数为最高；在相同的6BA浓度下，不定芽率以及不定芽数随着NAA浓度的增加而增加，当NAA浓度为1.0 mg·L1时， 不定

芽率以及不定芽数最高。在60 d的培养时间内，在各培养基上无愈伤组织产生，各培养基之间的不定芽诱导率无显著差异，均为100.00%，不定芽数以培养基MS+6BA 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1的最多。综上可知，6BA结合NAA可直接从叶片诱导出不定芽（图1：B），不能直接诱导出愈伤组织，因此，适宜的不定芽诱导培养基为MS+6BA 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1。

2.1.2 愈伤组织的诱导从表2可以看出，在30 d的培养时间内，添加了TDZ的培养基可从叶片直接诱导出愈伤组织，但无不定芽产生。在相同的NAA浓度下，愈伤诱导率随着TDZ浓度的增加呈现先上升后下降的趋势，当TDZ浓度为2.0 mg·L1时，愈伤诱导率最高；在相同的TDZ浓度下，愈伤诱导率随着NAA浓度的增加而增加，当NAA浓度为1.0 mg·L1时，愈伤诱导率最高。在60 d的培养时间内，各培养基的愈伤诱导率无显著差异，均为100%。此外，未获得从叶片直接诱导出的不定芽数，但获得了从愈伤组织分化出的不定芽，且各培养基之间的由愈伤组织分化出来的不定芽数具有显著差异，以培养基为MS+TDZ 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1的不定芽最多，显著高于其他培养基。综上可知，TDZ结合NAA可从叶片诱导出愈伤组织（图1： C）， 不能直接诱导出不定芽，随着培养时间的增加，可从愈伤组织分化出不定芽，因此，适宜的愈伤组织诱导培养基为MS+TDZ2.0 mg·L1+NAA0.10 mg·L1。

2.2 不定芽增殖培养

由表3可以看出，在培养基上附加不同浓度的植物生长调节剂对不定芽的增殖培养具有不同的影响。增殖系数随着KT和NAA浓度的增加而增加，同时，增殖系数也随着ZT和NAA浓度的增加而递增，当ZT为2.0 mg·L1、NAA为0.10 mg·L1，增殖系数最大，为11.09；当NAA的浓度相同时，ZT处理组增殖系数显著高于KT处理组增殖系数。因此，ZT更有利于褐纹报春苣苔的不定芽增殖，适宜褐纹报春苣苔不定芽增殖培养的培养基为MS+ZT 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1+活性炭0.05 g·L1，增殖系数为11.09，在此培养基上，植株生长好，无玻璃化（图1：D）。

2.3 愈伤组织的分化

由表4可知，随着植物生长调节剂浓度的增加，愈伤组织的分化系数随之增加，并在达到一定浓度后下降，即在一定的NAA或IAA浓度下，随着ZT浓度的增加，分化系数先增加后减少，但变化不显著；在一定的ZT浓度下，随着NAA或IAA浓度的增加，分化系数也呈现出先增加后减少的趋势。此外，添加NAA培养基的分化系数的显著高于添加IAA培养基的分化系数，当ZT浓度为1.0 mg·L1，NAA浓度为0.10 mg·L1时，分化系数最大（图1：E），而添加IAA的培养基，分化得到的植株长势差，玻璃化严重。综上可知，生长素中，NAA较IAA更适于褐纹报春苣苔的愈伤组织分化，适宜的分化培养基为MS+ZT1.0 mg·L1+NAA0.10 mg·L1，分化系数为12.46，植株长势好，苗健壮，无玻璃化。

2.4 生根培养与炼苗移栽

2.4.1 生根培养根据表5的数据进行方差分析可知，随着生长素浓度的增加，生根率随之增加，但增加不显著。在1/2MS的培养基上附加IBA浓度为0.10 mg·L1和0.50 mg·L1时，生根率最大，为100%，平均根长无显著差异，平均根数存在显著差异，但植株的生长都健壮。因此，适宜褐纹报春苣苔生根的培养基为1/2MS+IBA 0.1 mg·L1+活性炭0.05 g·L1或1/2MS+IBA 0.5 mg·L1+活性炭0.05 g·L1，生根率为100%，植株健壮，根长，根多，有利于后期的移栽成活（图1：F、G）。

2.4.2 炼苗移栽移栽好的褐纹报春苣苔应放置在遮阴处，保持空气湿度在75%以上，早晚浇水，保持基质湿润，20 d后，统计成活率，为100.00%（图1：H）。

3讨论与结论

植物生长调节剂是组培快繁的重要影响因子，不同种类的植物生长调节剂对外植体生长和分化的作用不同，同种植物生长调节剂浓度不同，其作用也有差异，因此，对外植体的脱分化、生长和分化有关键作用的是植物生长调节剂浓度的配比。本研究在叶片的初代诱导中采用了两种不同的细胞分裂素结合同一種生长素进行诱导，发现6BA结合NAA，仅能诱导不定芽而不能诱导愈伤组织，TDZ结合NAA仅能诱导愈伤组织而不能诱导不定芽，初代培养后期获得的不定芽是由愈伤组织分化得到的。这与前人的结果有所不同：谭晓风等（2009）在进行莨山唇柱苣苔组培快繁时，以6BA 1.0 mg·L1结合NAA 0.5 mg·L1获得较好的愈伤组织；文弢等（2016）则认为TDZ对大苞短毛唇柱苣苔的不定芽诱导起主要作用，浓度为0.5 mg·L1有利于诱导率和不定芽数量的提高；罗洁等（2016）以培养基MS+TDZ 2.0 μmol·L1+NAA 0.2 μmol·L1为双片苣苔叶片诱导不定芽发生的适宜培养基。可见，在前人的研究中，6BA结合NAA可以获得较好的愈伤组织，而TDZ结合NAA可以直接从叶片诱导出不定芽。但潘梅等（2015）发现，采用0.5 mg·L1的TDZ对黄花马铃苣苔不定芽的增殖效果并不理想，这与本试验的研究结果是相一致的。产生这种差异的原因是物种自身基因型的差异，此外，植物生长调节剂种类和浓度也是导致差异产生的重要原因。

通过组织培养获得再生植株的途径有两个：一是直接诱导不定芽途径，二是通过愈伤组织诱导不定芽途径。在已有的研究中，桂林小花苣苔（苏以丽，2012；黄宁珍等，2010a）和半蒴苣苔（阮慧泽等，2014；汤正辉等2005）通过两种途径成功建立了其组培快繁体系；菱叶报春苣苔（李翠等，2010）、多齿吊石苣苔（黄宁珍等，2010b）和刺齿唇柱苣苔（汤正辉等，2004）则通过愈伤组织诱导途径建立了组培快繁体系；而桂黔吊石苣苔（付传明等，2014）虽然可以诱导出愈伤组织，但愈伤诱导率较低、分化成苗困难。本研究通过两种途径成功建立了褐纹报春苣苔的组培快繁体系，但褐纹报春苣苔叶片直接诱导不定芽的组培快繁途径，比通过愈伤组织诱导不定芽途径更节省培养时间，而且可以避免因愈伤组织分化不定芽过程可能产生的变异，因此，直接诱导不定芽途径是褐纹报春苣苔组培快繁的有效途径。

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