初始发酵pH对秸秆酒精醪液沼气发酵及其系统内微生物群落的影响

朱浩然　李珂　张雅洁

摘要[目的]探究初始pH對秸秆酒精醪液厌氧发酵产甲烷的影响。[方法]利用秸秆酒精醪液作为唯一发酵底物，并将初始发酵pH分别设置为4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，8.5，采用序批式厌氧发酵30 d。[结果]在150 mL的发酵体积下最终的甲烷积累量依次为17、24、227、289、246、257、234和143 mL。当初始发酵pH升高时，发酵液中残留的挥发性脂肪酸（VFA）中的乙酸所占比例逐渐升高，pH为5.0时乙酸占12.8%，pH为8.5时乙酸占43.9%。通过比较初始pH为4.0、6.5和8.5时，VFAs在发酵过程中的动态变化，发现初始pH为6.5时，乙酸的含量在第1.5天达到峰值，为3 753.6 mg/L 占总量71.6%，最终乙酸被减少了72.4%；初始pH为8.5时，乙酸的含量在第10天时增至峰值，为1 322.9 mg/L（53.8%），最终乙酸减少了36.0%。初始pH为4.0时，VFAs的总量和组成都没有明显的变化。当初始发酵pH为6.0、6.5、7.0、7.5时，发酵系统内的优势细菌为梭菌属（Clostridium），相对丰度为40%～47%；優势古菌为甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）和甲烷鬃毛菌属（Methanosaeta），其相对丰度之和为85%～88%。当初始pH为8.5时，系统内的优势细菌为普雷沃式菌（Prevotella）和互养单胞菌属（Syntrophomonas），相对丰度分别为36.8%和14.7%；优势古菌为甲烷杆菌属（Methanobacterium）和甲烷热杆菌属（Methanothermobacter），在其全古菌序列中分别占 62.3%和 11.4%。[结论]当初始发酵pH为6.5时，甲烷的产气积累量最高；当初始发酵pH为6.0、6.5、7.0、7.5时，为乙酸营养型型甲烷发酵；当初始pH为8.0和8.5时，为氢营养型甲烷发酵。

关键词酒精醪液；初始pH；厌氧发酵；微生物群落

中图分类号S216.4文献标识码A文章编号0517-6611（2017）20-0065-05

Abstract[Objective]Exploring the impact of initial pH on anaerobic fermentative production of methane from waste liquor of alcohol from stalk.[Method]As the waste liquor of alcohol from stalk was the only fermentation substrate， sequencing batch reactor was utilized for 30 days when the initial pH was 4.0，5.0，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5 respectively. [Result] In the fermentation volume of 150 mL， the final methane accumulates to 17，24，227，289，246，257，234 and 143 mL respectively. When the initial pH was rising， the proportion of acetic acid in VFAsvolatile fatty acids remaining fermentation liquor was also increasing. Acetic acid was 12.8% in proportion when pH was 5.0 and acetic acid is 43.9% in proportion when pH was 8.5. Comparing the dynamic changes of VFAs during fermentation when the initial pH was 4.0，6.5 and 8.5， it turned out that the content of acetic acid reaches to the peak3 753.6 mg/L （71.6% of the total amount） 1.5 days later，and the final consumption of acetic acid was 72.4% when the initial pH was 6.5. Moreover， when the initial pH was 8.5， content of acetic acid reaches to the peak1 322.9 mg/L （53.8% of the total amount） 10 days later，and the final consumption of acetic acid was 36%. There was no obvious change of the total amount or composition of VFAs when the initial pH was 4.0. When the initial pH was 6.0，6.5，7.0，7.5， the dominant bacteria was Clostridium in fermentation system， and the relative abundance was 40%-47%；dominant archaeal was Methanosarcina and Methanosaeta， and the relative abundance was 85%-88%.However， the dominant bacteria was Prevotella and Syntrophomonas in fermentation system， and the relative abundance was 36.8% and 14.7% respectively；dominant archaeal was Methanobacterium and Methanothermobacter， and the relative abundance was 62.3% and 11.4% respectively when the initial pH was 8.5. [Conclusion] The gas from methane accumulates to the highest when the initial pH is 6.5；the dominating methanogenic substrates are acetate when the initial pH is 6.0，6.5，7.0 and 7.5；the dominating methanogenic substrates are H2CO2 when the initial pH is 8.0 and 8.5.

Key wordsAlcohol mash；Initial pH；Anaerobic fermentation；Microbial community

自20世纪能源危机爆发以来，生物质可再生能源便得到越来越多的关注。其中利用农作物秸秆发酵生产生物质乙醇技术得到了快速发展[1]。由于秸秆发酵乙醇在环境问题、粮食问题和能源问题上的重要意义，使其在全球得到了广泛的认可与重视。秸秆发酵乙醇的工艺主要是预处理（气爆、酶解），酵母发酵，蒸馏提纯；生产过程中会产生大量的高浓度有机醪液（化学需氧量高达20 000～60 000 mg/L），并且呈酸性（pH 2～5），有机悬浮物浓度高（悬浮固体高达10 000～40 000 mg/L）[2]。醪液直接排入环境中，不仅会对环境造成严重破坏，也不利于资源与能源的高效利用。目前国内外针对酒精醪液已有多种处理方法，例如DDGS法、浓缩燃烧法、浓缩制肥法、稀释农灌法以及生物处理法等[3]。利用厌氧发酵原理对酒精醪液进行厌氧消化最终产生甲烷，这一技术不仅符合废水资源化回收利用的清洁生产性质，也会给厂家带来一定的经济效益。

厌氧发酵是一种复杂的物理化学与微生物活动过程。厌氧消化过程产生的有机小分子酸主要包括乙酸、丙酸、丁酸、乳酸等。不同的发酵途径会产生多种特定的末端产物，起作用的微生物的种类不同。王晋[4]在文献综述中总结了能够以挥发性脂肪酸（VFA）为末端代谢产物的3类功能菌群：水解发酵产酸菌、产氢产乙酸菌和同型产乙酸菌。水解发酵产酸细菌可以将底物中复杂有机物（纤维素、蛋白质和脂类等）水解，再经过各自的产酸代谢途径将水解后的小分子转化为乙酸、丙酸等VFA。完成水解作用的细菌主要是严格厌氧的拟杆菌、梭菌及兼性厌氧的真杆菌等，而产酸发酵细菌则是产酸效率较高的产芽孢细菌，如梭菌科、链球菌科、芽孢乳杆菌科、毛螺菌科等。产甲烷菌是一类以甲烷为最终产物的微生物，该过程也是厌氧消化产甲烷的最终过程，因此被认为是直接影响甲烷产量的微生物。产甲烷菌一词是在 1974年由 Bryant 首次提出的，将产甲烷菌同嗜甲烷菌区别开。所有的产甲烷菌都有3个共同特征：①都能够产甲烷，并通过产甲烷获得生长所需要的大部分能量。②都属于古菌域中的广古菌门。③都是严格的厌氧菌。根据厌氧发酵产甲烷的原理，产甲烷菌和与之相关的功能性微生物在发酵过程中起到了重要作用[5]。而影响微生物生长的因素有很多，其中pH是一个重要因素[6]。相关文献表明，厌氧发酵的适合pH应该在6.0～8.3[7]；6.5～7.5时产气最好[8]；pH在6.8～7.2时启动速度最快[9]。目前针对酒精醪液厌氧发酵产甲烷的研究大多集中于木薯、玉米等淀粉类物质产酒精后的醪液，而以纯纤维素类物质如玉米秸秆或稻草等发酵后醪液的厌氧发酵研究还很少见。因此，笔者选用秸秆酒精醪液作为生物厌氧发酵产甲烷的底物，以39 ℃发酵，研究不同初始pH对厌氧发酵的积累甲烷产量、发酵产物VFAs的分布的影响，分析并探讨初始pH对秸秆酒精醪液厌氧发酵产甲烷及反应体系中微生物生长的影响。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1酒精醪液。

该试验中的酒精醪液取自吉林长春某秸秆酒精发酵厂的廢水厌氧发酵系统中反应器的中部，取样时系统运转良好。醪液水质呈酸性，总化学需氧量（TCOD）和总悬浮固体物质浓度（TS）较高，分别为7.4×104和6.1×104 mg/L。同时具有较高的可生化性，五日生化需氧量（BOD5）为1.5×104 mg/L，其他如溶解性化学需氧量（SCOD）、总氮（TN）、总磷（TP）、氨氮（NH+4-N）检测结果详见表1。为保证醪液水质的稳定性，将醪液储存于4 ℃的冰箱中备用。

1.1.2接种污泥。

接种污泥分别取自原发酵厂的厌氧污泥床（UASB）反应器中的厌氧颗粒污泥。为保持污泥活性，将其保存于4 ℃冰箱内。接种前6 h将污泥置于35 ℃摇床，振荡培养12 h使其恢复活性[9]。

1.2方法

所有的发酵试验均在自制的250 mL厌氧反应器（图1）中进行，向其中添加135 mL酒精醪液，15 mL活性污泥，并且使用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl将混合液的pH调节为为4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5。利用厌氧反应器上通入发酵液中的橡胶管向其中通入99.99%的氮气，10 min。之后，确保关闭反应器上所有的三通阀，用凡士林密封瓶盖，放入恒温培养箱内（上海一恒 MGC-450BP-2）培养，设置培养温度为（39±1）℃，振荡速率为150 r/min，厌氧发酵的周期为30 d。

1.3分析方法

该试验中的TCOD、SCOD、TN、TP、NH+4-N、TS及VS等常规指标均采用国标法测定。醪液、接种物和发酵液的pH通过pH计（梅特勒-托利多）测定。气体组分使用气相色谱仪（北京京科瑞达）测定，热导检测器（TCD），色谱柱为PropoR-Q（2 m×3 m）柱，载气采用氦气，其流速为25 mL/min，气体进样量为1 mL，定量方法为外标法。VFA（乙酸、丙酸、正丁酸之和）通过高效液相色谱仪（日本岛津）测定，缓冲液为0.1%的磷酸缓冲液；色谱柱为C18反相柱；检测器为紫外可见光检测器，进样量为20 μL，流速为1.0 mL/min。底泥总DNA的提取采用试剂盒（Fast DNA SPIN kit for soil），提取过程按试剂盒说明书进行。测序平台为MiSeq测序平台（上海美吉），PCR扩增引物对于细菌是338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG3′）和806R（5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT3′）；对于古菌是519F（5′CAGCMGCCGCGGTAA3′）和915R（5′GTGCTCCCCCGCCAATTCCT3′）。PCR采用Trans Gen AP22102：Trans Start Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反应体系。细菌PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；然后95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27个循环。古菌PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；然后95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，32个循环。

高通量测序所得的序列通过 QIIME（http：//qiime.org/tutorials/index.html）和RDP Classifier[10]（version 2.2 http：//sourceforge.net/projects/rdpclassifier/，置信度阈值为0.7）进行处理，比对数据库为Silva[11]（Release119 http：//www.arbsilva.de）。

2结果与分析

2.1不同初始发酵pH条件下各反应器的甲烷发酵规律

在控制除pH以外的所有条件下，经30 d的序批式厌氧发酵，8组反应器内的发酵系统基本处于稳定。根据图2，所有反应器在150 mL的发酵体积下最终甲烷积累量由高至低依次是pH 6.5（289 mL）、pH 7.5（257 mL）、pH 7.0（246 mL）、pH 8.0（234 mL）、pH 6.0（ 227 mL）、pH 8.5（143 mL）、pH 5.0（24 mL）、pH 4.0（17 mL）。在发酵后12 h就已启动的反应器共有5组，分别是pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5和pH 8.0，产气量依次是28、53、46、44、8 mL。pH 4.0和pH 5.0在发酵开始后，基本没有太明显的发酵活动，产气也极其微弱。而pH 8.5在发酵开始后第4天才有明显的产气活动。根据图3，pH 8.5发酵第1天到第4天的日产气量分别是4.0、9.0、1.5、11.5 mL，而发酵启动最快的pH 6.5发酵开始4 d内的日产气量分别为88.0、78.0、7.5、6.5 mL。pH 6.0、pH 7.0、pH 7.5的产气规律较为相似。同时分析发现，所有反应器在发酵开始20 d后，日产气量均低于5 mL。综上，当pH接近于中性时有利于厌氧发酵的启动；pH偏碱性时厌氧发酵会滞后，pH过低时厌氧发酵不能正常启动。

2.2不同初始发酵pH条件下各反应器内发酵过程中VFA含量的变化

根据图4可知，當初始发酵pH不同时，各反应器内的VFA积累曲线具有一定的差异性。当初始pH为4.0和5.0时，系统内的VFA含量变化不明显。当初始pH为6.5时，系统内的VFA含量以最快的速度达到所有反应器内的峰值，即发酵开始后1.5 d达到4 386 mg/L。当初始pH低于或者高于6.5时，其系统内的VFA含量出现的峰值都要小于反应器pH 6.5内的峰值，各反应器内VFA的含量最高时为pH 6.0（4 058 mg/L）、pH 7.0（4 041 mg/L）、pH 7.5（3 998 mg/L）、pH 8.0（3 259 mg/L）、pH 8.5（2 459 mg/L）、pH 5.0（1 299 mg/L）、pH 4.0（1 178 mg/L）。其中当初始pH为8.5时，反应器在发酵开始后的第10天才达到VFA含量的峰值，同甲烷产气的积累曲线一样出现了滞后现象。以上说明甲烷发酵的启动速度与VFA的积累速度有直接关系。所有反应器发酵结束后，最终的VFA含量由高至低依次为pH 8.5（1 936 mg/L）、pH 7.0（1 659 mg/L）、pH 6.5（1 630 mg/L）、pH 6.0（1 516 mg/L）、pH 8.0（1 425 mg/L）、pH 7.5（1 382 mg/L）、pH 5.0（1 257 mg/L）和pH 4.0（1 146 mg/L）。

2.3初始pH为4.0、6.5和8.5时系统内VFA组成的动态变化

图5为初始pH 4.0、6.5、8.5时，发酵开始1.5、4.0、10.0、18.0和30.0 d时发酵系统内VFA的组成情况。在发酵开始初期，3组反应器内的VFA组成情况为乙酸11.7%（97.30 mg/L）、丙酸36.3%（302.00 mg/L）、丁酸52.0%（432.64 mg/L）。当初始pH为4.0时，发酵过程中主要变化的成分是丙酸和丁酸，乙酸的含量从发酵开始后缓慢增长，最终为198.3 mg/L（17.3%），丙酸和丁酸最终的含量分别为58.4 mg/L（5.1%）和889.3 mg/L（77.6%），这说明系统内的乙酸菌被严重抑制，丁酸菌成为了优势菌。在初始pH为6.5的反应器内，乙酸含量变化起伏较大，在发酵开始后1.5 d，乙酸的含量由97.3 mg/L（11.7%）激增至3 753.6 mg/L（71.6%），之后乙酸的含量又持续较低，最终为386.3 mg/L（2.4%），而丙酸和丁酸最终的含量分别为133.6 mg/L（8.2%）和1 110.0 mg/L（6.8%）。这可能是因为在反应器pH 6.5内，乙酸菌在发酵前期大量繁殖，所以乙酸的含量迅速升高，随着发酵的持续发酵基质减少以及乙酸型产甲烷菌的存在，乙酸的含量又迅速减少。当发酵pH为8.5时，系统内丙酸和丁酸含量的变化与pH为6.5时相似，最终的含量分别为311.7 mg/L（1.6%）和774.4 mg/L（40.0%）。乙酸的含量自发酵开始后变化缓慢，但发酵时间持续到第10天时乙酸的含量增至1 322.9 mg/L（53.8%），最终消耗至849.9 mg/L（43.9%），相较于反应器pH 6.5，反应器pH 8.5内最终的乙酸含量比峰值减少了36.0%，而pH 6.5内却减少了72.4%。以上说明当初始发酵pH为8.5时，系统的产乙酸菌生长缓慢，且系统内没有优势的乙酸型产甲烷菌，从而造成了pH 8.5内乙酸的堆积。

2.4发酵系统内中的微生物群落

在历经30 d的厌氧发酵后，8组不同初始发酵pH的发酵系统已基本停止产生甲烷。提取发酵液中的DNA，通过Miseq高通量测序分析其中的细菌和古菌菌落的结构特征。测序共得到有效的细菌序列157 107条以及有效的古菌序列87 228条，所有反应器内的细菌覆盖度超过99%，所有反应器内古菌的覆盖度超过了99.9%，所以此次测序所得的序列深度能够充分代表各反应器内的细菌和古菌种类。

2.4.1不同初始发酵pH反应器内细菌菌落的结构。

所得全部序列在经过一系列的质量控制后，按照97%相似性进行OTU的聚类，并且合并相对丰度低于1%的细菌菌属之后，得图6。如图6所示，不同初始发酵pH的反应器内细菌菌落在属水平上结构差异性较为明显。明显地，反应器pH 4.0和pH 5.0的细菌菌属结构相似，它们的优势菌属为拟杆菌门的拟杆菌属，其相对丰度分别是35.7%和37.3%。而梭菌属在反应器pH 6.0、6.5、7.0和7.5中有着绝对的优势，其相对丰度依次为40.5%、46.7%、42.3%和40.4%，梭菌属是一类同型产乙酸菌，因此还可能利用 H2 和 CO2 产生乙酸，供乙酸利用型的产甲烷菌如甲烷鬃毛菌属或甲烷八叠球菌作为底物产甲烷[12]。同时隶属于厚壁菌门的毛螺旋菌属和属于互养菌门的互养单胞菌属也有较高的分布，其在全菌序列中所占比例分别为13%～22%和8%～15%。当初始发酵pH变为8.0和8.5时，发酵系统内的细菌菌落分布又有了较大的变化，具体表现为，原本在中性或者酸性的初始发酵环境中的优势菌梭菌属的相对丰度大幅减少，其在pH 8.0和8.5中的相对丰度分别为12.8%和8.9%，优势菌变化为普雷沃式菌和互养单胞菌属，它们能与氢营养型的产甲烷菌，例如甲烷杆菌属，合作共生将长链脂肪酸降解转化乙酸和氢[13]。它们的相对丰度分别为25.3%、36.8%和13.9%、14.7%。同时发现，隶属于螺旋体门的密螺旋菌属在初始发酵pH接近中性时有着较为丰富的含量，其在pH 6.0、6.5、7.0和7.5中的相对丰度依次为7.3%、5.9%、7.8%和3.2%，而在其他反应器内的含量均小于2%，并且该菌同样是一类同型产乙酸菌。并且在各反应器内还发现了硝化螺旋菌属、共养杆菌属、脱硫弧菌属、绿湾菌属和一些含量较少的菌属。以上结果说明，当初始pH接近中性时有利于产乙酸菌得生长，当初始pH偏碱性时则会抑制产乙酸菌从而造成产氢菌的大量繁殖。

2.4.2不同初始发酵pH反应器内古菌菌落的结构.

在全部的反应器中，广古菌门是绝对的优势菌，其在反应器pH 4.0中的相对丰度依次为94.3%、94.7%、96.8%、97.4%、98.2%、97.3%、96.9%和98.3%，并且还有少部分的古菌属于奇古菌门和泉古菌门。对所有反应器中的全古菌库在属的水平上进行分析，根据图7，各反应器的古菌菌落差异较为明显，其中pH 4.0和5.0的古菌菌落结构较为相似，且优势菌的分布也较为均匀，具体的优势菌为甲烷杆菌属、甲烷八叠球菌属以及甲烷热杆菌属，该3类产甲烷菌在pH 4.0中的相对丰度依次为33.8%、19.7%和23.5%，在pH 5.0中的相对丰度依次为29.1%、19.3%和26.4%。而反应器pH 6.0、6.5、7.0、7.5的古菌菌落的结构相似度较高，该4组反应器的优势菌均为隶属于甲烷八叠球菌目的甲烷鬃毛菌属和甲烷八叠球菌属，这是2类乙酸营养型产甲烷菌。两者所占全古菌菌库之和依次为85.1%、87.9%、85.4%以及86.8%。其中pH 6.5的甲烷八叠球菌属含量最高，为50.8%；pH 6.0的甲烷鬃毛菌属含量最高为46.3%。同样地，甲烷八叠球菌属和甲烷鬃毛菌属在pH 8.5中的相对丰度仅为9.4%与9.9%，其发酵系统内的优势古菌为隶属于甲烷杆菌目的甲烷杆菌属和甲烷热杆菌属，其在反应器pH 8.5中的全古菌序列中分别占62.3%和11.4%，而甲烷杆菌属和甲烷热杆菌属是2类氢营养型的产甲烷菌。造成上述现象的原因可能是，当初始发酵pH接近中性时，系统内存在大量产乙酸细菌，如梭菌属、密螺旋菌属，促进了乙酸型产甲烷菌的生长如甲烷鬃毛菌属和甲烷八叠球菌属。相反地，当初始pH偏碱性时，系统内产乙酸菌的生长会受到抑制产氢细菌大量繁殖，从而促使了氢营养型产甲烷菌的繁殖。而一个良好的沼气反应器中产甲烷的主要途径应该是乙酸型的产甲烷途径[14-15]，所以这可能就是反应器pH 8.5产气不良的主要原因。

3结论与展望

当初始发酵pH为6.5时，甲烷的产气最高。过低的pH会抑制参与水解了大分子有机物的微生物和产甲烷

菌的生长，造成发酵系统不能正常启动；过高的pH则会阻碍产乙酸

菌的生长，从而导致产氢菌的繁殖，最终导致氢营养型的

甲

烷菌成为优势菌，从而造成不良产气效果。該研究还缺乏对

整个发酵阶段的微生物动态变化进行系统性的研究，结论的数据支持还不够完整，最后希望能够通过该研究给酒精醪液发酵产业及研究带来一定的技术支持。

参考文献

[1] 中华人民共和国国家发展计划委员会基础产业发展司.中国新能源与可再生能源1999 白皮书[M].北京：中国计划出版社，2000.

[2] 杨霞.糖蜜酒精废液的厌氧生物处理及反应器中微生物群落结构分析[D].南宁：广西大学，2012.

[3] 石智慧.纤维素乙醇废水生物处理技术研究[D].武汉：武汉理工大学，2010.

[4] 王晋.厌氧发酵产酸微生物种群生态及互营关系研究[D].无锡：江南大学，2013.

[5] SHIN S G，LEE S，LEE C，et al.Qualitative and quantitative assessment of microbial community in batch anaerobic digestion of secondary sludge[J].Bioresource technology，2010，101（24）：9461-9470.

[6] WANG X J，YANG G H，FENG Y Z，et al.Optimizing feeding composition and carbonnitrogen ratios for improved methane yield during anaerobic codigestion of dairy，chicken manure and wheat straw[J].Bioresource technology，2012，120（8）：78-83.

[7] 王曉娇.混合原料沼气厌氧发酵影响因素分析及工艺优化[D].杨凌：西北农林科技大学，2013.

[8] GU Y，CHEN X H，LIU Z G，et al.Effect of inoculum sources on the anaerobic digestion of rice straw[J].Bioresource technology，2014，158（4）：149-155.

[9] KAWAI M，NAGAO N，TAJIMA N，et al.The effect of the labile organic fraction in food waste and the substrate/inoculum ratio on anaerobic digestion for a reliable methane yield[J].Bioresource technology，2014，157（1）：174-180.

[10] WANG Q，GARRITY G M，TIEDJE J M，et al.Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy[J].Applied and environmental microbiology，2007，73（16）：5261-5267.

[11] QUAST C，PRUESSE E，YILMAZ P，et al.The SILVA ribosomal RNA gene database project：Improved data processing and webbased tools[J].Nucleic acids research，2013，41：590-596.

[12] ZHANG S，BANASZAK J E，PARAMESWARAN P，et al.Focusedpulsed sludge pretreatment increases the bacterial diversity and relative abundance of acetoclastic methanogens in a fullscale anaerobic digester[J].Water research，2009，43（18）：4517-4526.

[13] ZENED A，COMBES S，CAUQUIL L，et al.Microbial ecology of the rumen evaluated by 454 GS FLX pyrosequencing is affected by starch and oil supplementation of diets[J].FEMS microbiology ecology，2013，83（2）：504-514.

[14] LIU Y C，WHITMAN W B.Metabolic，phylogenetic，and ecological diversity of the methanogenic archaea[J].Annals of the New York academy of sciences，2008，1125（1）：171-189.

[15] VALCKE D，VERSTRAETE W.A practical method to estimate the acetoclastic methanogenic biomass in anaerobic sludges[J].Journal（Water pollution control federation），1983，55（9）：1191-1195.