不同诱导子对油樟内生菌次生代谢产物的影响

汪超 谭韵雅 杨胜伟

摘要[目的]提高油樟內生菌次生代謝产物的积累。[方法] 将不同诱导子（油樟油水浊液、油樟叶水提液和油樟愈伤组织）添加到油樟内生菌（YY26、YG42）的培养体系中，研究其对内生菌生长及其次生代谢产物（1，8-桉叶油素、松油烯-4-醇、α-松油醇）的影响。[结果]从内生菌生长情况来看，油樟愈伤组织对内生菌YY26的生长有明显抑制作用，而对YG42的生长有促进作用；油樟油水浊液对2种内生菌的生长都有一定的抑制作用；油樟叶水提液对2种内生菌的生长均无显著影响。从次生代谢产物积累来看，油樟叶水提液对2种内生菌产1，8-桉叶油素、松油烯-4-醇及α-松油醇具有较强的促进作用，且对1，8-桉叶油素的促进作用最强。当油樟叶水提液浓度为1.00%时，内生菌YY26的1，8-桉叶油素产量最高，比对照组提高了11.80倍；当油樟叶水提液浓度为2.50%时，内生菌YG42中的1，8-桉叶油素产量达到最大值，与对照组相比增加了7.73倍。油樟愈伤组织对总挥发性物质的促进作用最强，当其浓度为10.00%时，对内生菌YY26总挥发性物质的促进作用最强，比对照组提高了13.26倍。[结论]该研究在一定程度上提高了油樟内生菌（YY26、YG42）次生代谢产物的积累量，为其今后的工业化生产奠定了基础。

关键词油樟；内生菌；1，8-桉叶油素；松油烯-4-醇；α-松油醇

中图分类号Q942文献标识码A文章编号0517-6611（2017）20-0014-04

Abstract[Objective] To improve the accumulation of secondary metabolites of endophytic fungi of Cinnamomum longepaniculatum. [Method] Different inducers（oil， water extract and callus from C. longepaniculatum，were added in the culture system of endophytic fungi（YY26，YG42）of C. longepaniculatum to study their effects on the growth of endophytic fungi and their secondary metabolites（1，8eucalyptol， terpinen4ol， αterpineol）. [Result] As for the growth of endophytic fungi， callus from C. longepaniculatum had obvious inhibitory effects on the growth of YY26，but it had promoting effects on the growth of YG42. Oil from C. longepaniculatum had some inhibiting effects on the growth of YY26 and YG42. Water extracts from C.longepaniculatum had no significant effect on the growth of YY26 and YG42. As for the accumulation of secondary metabolites，water extract from C.longepaniculatum had stronger promoting effects on the yield of 1，8 cineole， terpinen4ol and αterpineol of YY26 and YG42， and it had the strongest promoting effects on the yield of 1，8 cineole.When the concentration of water extract was 1.00%，the yield of 1，8cineole of YY26 was the highest， which was increased than that of control group by 11.80 times. When the concentration of water extract was 2.50%， the yield of 1，8cineole of YG42 was the highest， which was increased than that of control group by 7.73 times.Callus from C.longepaniculatum had the strongest promoting effects on total volatile of secondary metabolites. When the concentration of callus from C.longepaniculatum was 10.00%，it had the strongest promoting effects on total volatile substances of YY26， which was increased than that of control group by 13.26 times. [Conclusion]The accumulation amount of secondary metabolites of YY26 and YG42 in C.longepaniculatum were improved， which can lay a foundation for its industrialized production in the future .

Key wordsCinnamomum longepaniculatum；Endophytic fungi；1，8cineole；Terpinen4ol；αterpineol

植物内生菌在长期的进化过程中，与宿主细胞形成了互利共生的友好关系。目前，有关内生菌生物学作用的研究报道逐年增多，尤其是关于内生菌次级代谢产物积累的研究已成为热点[1-2]。从植物中直接分离的内生菌，其次级代谢产物的含量目前普遍偏低，工业化批量生产困难[3-4]。因此，提高植物体内内生菌中的次级代谢产物显得尤为重要。目前，提高植物体内内生菌中的次级代谢产物的方法很多，其中将生物因子（前体物质）作为诱导子来影响代谢产物的积累，是一种有效且易操作的方法[5-6]。

宿主细胞与内生菌之间存在物质交换，因此宿主植物细胞中可能存在促进内生菌产生次生代谢产物的前体物质。从宿主植物细胞中提取相关的代谢物，并将其作为诱导子添加到内生菌的培养体系中，可能会促进内生菌次级代谢产物的积累。笔者在油樟内生菌（YY26、YG42）培养体系中添加不同诱导子（油樟油、油樟水提液及油樟愈伤组织），研究其对内生菌次生代谢产物的影响，旨在提高内生菌次生代谢产物的产量。

1材料与方法

1.1试验材料

①3种诱导子：油樟油水浊液、油樟叶水提液及油樟愈伤组织。②2种油樟内生菌：YY26[从油樟叶中分离的真菌，编号为26，鉴定为子囊菌纲酵母目内孢霉科拟内孢霉属（Endomycopsis Dekker）]和YG42[从油樟根中分离的真菌，编号为42，鉴定为半知菌类从孢梗目从孢梗科稀丝头孢霉属（Haplotrichum LK.ex Fr.）][7]，由宜宾学院发酵资源与应用四川省高校重点实验室提供。1，8-桉叶油素、松油烯-4-醇及α-松油醇均购自北京世纪奥科生物技术有限公司。

1.2培养基

①平板培养基（1 L）：麦芽浸膏20 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，琼脂20 g，pH 5.0。②发酵培养基（1 L）：麦芽浸膏20 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，pH 5.0。

1.33种诱导子的制备

1.3.1油樟油水浊液诱导子的制备。采摘新鲜的油樟叶，洗净后剪碎，放入烧瓶中，水蒸气蒸馏4 h。先用乙醚萃取，再用旋蒸仪浓缩。用无水硫酸钠干燥，得到油樟叶挥发油。然后配制乳化剂，将吐温-80和斯盘-80按体积比 7∶3混合均匀，置于60 ℃水浴锅中充分搅拌。此混合乳化剂的HLB（亲水亲油平衡值）值为12.0（水包油乳化剂）。最后，将油樟叶挥发油与乳化剂按体积比1∶5混合，倒入研钵中，沿同一个方向充分研磨（约1 min），再加入水，研磨并过滤，灭菌备用。

1.3.2油樟叶水提液诱导子的制备。将新鲜的油樟叶片洗净并晾干，取40 g置于打浆机中，添加一定的蒸馏水打磨2 min，过滤后得到水提液，灭菌备用。

1.3.3

油樟愈伤组织诱导子的制备。取培养20 d后新鲜的油樟愈伤组织（培养条件为 B5+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+3.0%蔗糖+0.7%琼脂，pH 5.8，25 ℃），置于研钵中充分研磨，得到油樟愈伤组织诱导子。

1.4孢子悬液的制备

将YG42、YY26内生菌分别接种于平板培养基上，28 ℃下培养4 d，然后用无菌水洗涤平板，得到孢子菌悬液，并稀释其浓度至107个/mL。

1.51，8-桉葉油素、松油烯-4-醇和α-松油醇3种物质混合标样的制备与检测

分别称取1，8-桉叶油素、松油烯-4-醇和α-松油醇各0.5 g，置于容量瓶中，用乙醇将其配制成浓度10 g/L的3种标准溶液。混合标样的配制，则用超纯水将其稀释为0.01 mg/L。将细胞发酵液和混合标样分别顶空进样，采用气相色谱（GC）检测。

气相色谱检测条件如下：HP-5（30 m×320 μm×0.25 μm）毛细管柱，平衡温度95 ℃，平衡时间20 min；载气为氮气，氢气流速30 mL/min，空气流速400 mL/min，氮气尾吹气25 mL/min，顶空进样，分流比3.0。柱箱程序如下：90 ℃保持4 min，然后以20 ℃/min增至130 ℃保持5 min，再以 20 ℃/min 增至190 ℃保持1 min，最后20 ℃/min增至240 ℃保持1 min。

1.6生物量的测定将细胞培养物抽滤得到细胞，置于烘箱中45 ℃干燥至恒重，称其质量为细胞干重。

1.7诱导子的添加

在2种孢子悬液中分别添加不同浓度的诱导子（油樟油水浊液、油樟葉水提液和油樟愈伤组织），在最适培养条件下发酵后，取样并检测其生物量及次级代谢产物（1，8-桉叶油素、松油烯-4-醇、α-松油醇及总挥发性物质）的积累量，分析3种诱导子对次生代谢产物积累的影响。由于总挥发性物质无法用标品定量，因此所有产物均用峰面积表示积累量。

1.8精密度和稳定性试验

取配制的0.01 mg/L混合标样10 mL置于顶空进样瓶中，按照“1.5”中方法重复进样5次，计算1，8-桉叶油素、松油烯-4-醇、α-松油醇及总挥发性物质的峰面积RSD分别为1.62%、1.83%、1.71%、1.59%；取同一供试品在同一天内重复进样5次，并连续进样3 d，计算1，8-桉叶油素、γ-松油烯、α-松油醇及总挥发性物质的峰面积RSD分别为1.96%、1.69%、1.38%、1.82%。

1.9回收率试验

取“1.5”中配制的10 g/L标准溶液，以超纯水为溶剂，配制成浓度分别为1.0、0.5、0.1 mg/L的混合标样，分别取5 mL置于顶空进样瓶中，再分别加入5 mL已测样品，按照“1.5”中方法进行测定，计算出1，8-桉叶油素、松油烯-4-醇、α-松油醇及总挥发性物质的峰面积的回收率分别为101.12%、99.89%、99.47%、100.43%，RSD分别为1.78%、1.92%、1.66%、1.44%。

2结果与分析

2.1样品中挥发性成分鉴定结果

发酵液中挥发性成分鉴定结果见图1。从图1可以看出，1，8-桉叶油素、松油烯-4-醇和α-松油醇的出峰时间分别为2.840、5.157和5.325 min。样品（图1B）与标品（图1A）的出峰时间相同，被认为是与标品相同的物质。

2.2诱导子对内生真菌生物量的影响

由表1可知，油樟愈伤组织对YG42的生物量具有促进作用，且随着其浓度的增加，促进作用逐渐增强，当其浓度为10.00%时YG42的生物量比对照组增加了23.61%。油樟叶水提液对2种内生菌均无显著影响；油樟油水浊液诱导子对2种内生菌均有一定的抑制作用，且随着其浓度的增加，对内生菌的抑制作用逐渐增强。当油樟油水濁液浓度为10.00%时，YY26和YG42的生物量分别为对照组的71.12%和70.53%。油樟愈伤组织对YY26的生物量具有抑制作用，随着其浓度的增加，抑制作用逐渐增强。当其浓度为10.00%时，YY26的生物量仅为对照组的31.10%。

2.3诱导子对内生真菌1，8-桉叶油素的影响

由表2可知，油樟水提液对2种内生菌的1，8-桉叶油素积累均具有促进作用，其促进作用呈先增加后降低的趋势，当油樟水提液浓度为1.00%时，YY26的1，8-桉葉油素积累量最高，与对照组相比增加了11.80倍，当油樟水提液浓度为2.50%时，YG42的1，8-桉叶油素积累量最高，与对照组相比增加了7.73倍。油樟油水浊液对2种内生菌的1，8-桉叶油素积累均具有先促进后抑制的作用，当其浓度为0.25%时YY26和YG42的1，8-桉叶油素积累量最高，与对照组相比分别提高1.11和1.29倍。油樟愈伤组织对受试菌体的1，8-桉叶油素积累均呈抑制作用，且随着浓度的增加其抑制作用逐渐增强，当愈伤组织浓度为10.00%时，2种内生菌的1，8-桉叶油素积累量最低，分别为对照组的45.12%和52.77%。

安徽农业科学2017年

2.4诱导子对内生真菌松油烯-4-醇的影响

由表3可知，油樟水提液均能促进2种内生菌松油烯-4-醇的产生，当其浓度为1.00%时，2种内生菌的松油烯-4-醇产量均达到最大值，分别为8.32和5.86。油樟愈伤组织能诱导内生菌YY26松油烯-4-醇的产生，而对YG42内生菌的积累松油烯-4-醇几乎无影响，当其浓度为1.00%时内生菌YY26松油烯-4-醇的积累量达到最大值，为0.38。而油樟油水浊液对2种内生菌的松油烯-4-醇积累均呈抑制作用，且浓度越大，抑制作用越强。

2.5诱导子对内生真菌α-松油醇的影响

由表4可知，油樟愈伤组织诱导子对内生菌YY26产α-松油醇具有一定的促进作用，随着其浓度的增加，促进作用呈先强后弱的趋势，当其浓度为2.50%时内生菌YY26中α-松油醇积累量达到最大值（0.5），而对内生菌YG42中α-松油醇的积累量几乎无影响。油樟水提液对2种内生菌中α-松油醇的积累量均呈先促进后抑制的作用，当油樟水提液浓度为1.00%时对内生菌YY26中α-松油醇积累量的促进作用最强，此时α-松油醇积累量为3.96；当油樟水提液浓度为0.50%时，对内生菌YG42中α-松油醇积累的促进作用最强，此时α-松油醇积累量为1.30。油樟水浊液对2种内生菌中α-松油醇积累均具有抑制作用，且其浓度越大，抑制作用越强。

2.6诱导子对内生真菌总挥发性物质的影响

从表5可以看出，3种诱导子对内生菌的总挥发性物质的影响程度各不相同。油樟愈伤组织对内生菌YY26的总挥发性物质积累表现出诱导作用，而对内生菌YG42的总挥发性物质积累无显著影响，且随着浓度的增加，其促进作用越强，当浓度为10.00%时其促进作用最强，与对照组相比提高了13.26倍。油樟水提液对内生菌YY26中总挥发性物质的积累具有先促进后抑制的作用，当其浓度为1.00%时其促进作用最强，与对照组相比提高了0.87倍；对内生菌YG42中总挥发性物质的积累具有抑制作用，且随着浓度的增加，其抑制作用越强。油樟油对2种内生菌的总挥发性物质积累均具有抑制作用，且浓度越大，抑制作用越强，与之前研究结果基本一致。

3结论与讨论

向发酵培养基中添加诱导子是促进次生代谢产物产量常用的方法。该试验结果表明，油樟油诱导子在低浓度时对2种内生菌的1，8-桉叶油素产量均具有诱导作用，而在高浓度下却对其具有抑制作用，考虑到油樟油中本身就含有大量的1，8-桉叶油素，据此推测可能是外源1.8-桉叶油素对2种内生菌产1，8-桉叶油素的相关基因的表达存在调节作用。Expósito等[8]研究表明外源紫杉醇诱导子对紫杉醇相关基因的表达存在调控作用。在高浓度时油樟油对2种内生菌的生长具有一定的抑制作用，可能是因为油樟油中本身有轻微的毒性[9-10]；在高浓度下油樟油对2种内生菌中挥发性物质的积累均有抑制作用，可能是由于油樟油本身具有挥发性，在充满菌丝体的培养基中产生涡旋作用，使其挥发速度比对照组快，也可能是被内生菌转化为其他物质，具体还有待进一步研究。

油樟水提液对2种内生菌的1，8-桉叶油素、松油烯-4-醇和α-松油烯的积累均具有明显的促进作用，表明油樟水提液中可能含有某些能促进1，8-桉叶油素等生产的物质，这些物质能够诱导1，8-桉叶油素等物质生物合成相关基因的表达。吴欣[6]在滑桃树种子提取物对其内生菌Streptomyces sp.WXC 菌株中富伦菌素B产量的影响研究中，证实滑桃树种子提取物作为诱导物诱导了活性化合物富伦菌素B生物合成基因的表达，进而提高了富伦菌素B的产量，但具体作用机制还需进一步研究。

油樟愈伤组织对油樟内生真菌YY26的生长具有抑制作用，但却促进了其次生代谢产物的生成，表明在逆境的情况下有利于内生菌产次生代谢产物。对YG42的生长却具有促进作用，表明油樟愈伤组织中会产生一些物质对YY26的生长有抑制作用，而其中的一些物质又能够为YG42提供生长的必要因子，促进YG42的生长，但对其次生代谢产物的积累却无显著影响，可能是由于营养物质都用于细胞生长，而1，8-桉叶油素等物质的基因缺乏表达。

综上所述，培养基中的营养成分对油樟内生真菌中次生代谢产物积累的影响较大。从油樟水提液与油樟愈伤组织的不同诱导效果来看，1，8-桉叶油素等物质的生物合成受许多因素的影响，油樟水提液中含有细胞组织液及其他油樟内生菌所产物质比油樟愈伤组织中所含物质丰富。因此，在今后的研究中应加强对营养成分的优化，还可尝试多种内生菌共培养的发酵方式。该研究提高了油樟内生真菌YY26和YG42的次生代谢产物的积累量，为其今后的工业化生产奠定了基础。

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