植物细胞重编程机制及其在苔藓植物中的研究进展

张晓青 杨静薇 王嘉靖

摘要 重编程在植物组织培养和干细胞治疗等领域有潜在的应用价值。目前，影响陆生植物重编程的分子机制还不清楚，而且缺少从进化-发育角度对重编程的研究。通过建立模式生物小立碗藓的再生体系，研究共有因子PpCSP1/Lin28调控高等植物重编程的作用机制，并对今后的研究进行展望。

关键词 细胞重编程；小立碗藓；拟南芥；冷激蛋白

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）28-0148-03

Abstract Reprogramming has potential applications value in plant tissue culture and stem cell therapy，but its molecular mechanism is still unknown in land plants，and there is a lack of research on reprogramming from evolutiondevelopmental perspective.In this paper，the regulation mechanism of the cofactor PpCSP1 / Lin28 on reprogramming of higher plant was studied by establishing the regenerative system of Physcomitrella patens，and the future research was prospected.

Key words Cellular reprogramming；Physcomitrella patens；Arabidopsis thaliana；Coldshock domain protein

干细胞（stem cell）具有自我更新（selfrenew）和产生可分化细胞的能力[1]。虽然多细胞性（multicellularity）和干细胞系统在陆生植物（land plants）和后生动物（metazoa）中独立进化而来，但是二者的干细胞形成和维持存在相似之处。陆生植物和后生动物干细胞的维持均由其所处的微环境，即干细胞小生境（stem cell niche）所控制[2-4]。干細胞小生境的稳态调控对干细胞的自我更新及分化成新的组织和器官至关重要。

在陆生植物和后生动物中，已分化的细胞在特定条件下自身细胞命运可以逆转为干细胞，这个过程称为重编程（reprogram）。在哺乳动物细胞中，诱导性多功能干细胞（induced Pluripotent Stem Cell，iPSC）的发现是重编程研究中的重大突破，即诱导表达Oct4、Sox2、cMyc和Klf4 （Krueppellike factor 4）这4个因子能够使体细胞重编程为多功能干细胞[5-6]。此外，另一组多功能干细胞因子Oct4、Sox2、Nanog和Lin28的表达也能够成功诱导人成纤维细胞成为iPSC [7]。iPSC的发现证明了哺乳动物的体细胞可以重编程为多功能干细胞。同样，在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）里异位表达一些干细胞因子，如WUS （WUSCHELRELATED HOMEOBOX 5）、PLT （PLETHORA）、BBM （BABY BOOM），也能异位再生干细胞小生境和体细胞胚[8-10]。虽然重编程广泛发生于陆生植物和后生动物中，但目前人们对其分子机制的认识还十分有限。通过建立模式生物小立碗藓（Physcomitrella patens）的再生体系，研究共有因子PpCSP1/Lin28调控高等植物重编程的作用机制，以期揭示这一基本生命现象的进化-发育生物学意义[11]。

1 高等植物细胞重编程

植物的重编程能力普遍强于动物。在合適的植物激素（生长素/细胞分裂素）处理下，已分化的细胞可以形成一团脱分化的细胞，即愈伤组织（callus）。愈伤组织可以再生出包含干细胞的茎端分生组织（shoot apical meristem，SAM）和根端分生组织（root apical meristem，RAM） [12]。来源于胡萝卜根的单一细胞能够经过愈伤组织再生出完整的植株，证实了植物细胞在特定条件下能够重编程为全能干细胞（totipotent stem cell）[13]。在模式植物拟南芥中，一些参与愈伤组织形成的基因被鉴定出来。Fan等[14]发现LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN（LBD）家族转录因子LBD16、LBD17、LBD18和LBD29受生长素调控，能够强烈诱导拟南芥侧根的形成，过量表达这4个基因中的任意一个即可不依赖外源激素而诱导愈伤组织的形成。He等[15]发现clf （curly leaf）突变体的叶片在合适的激素处理下并不能形成愈伤组织，而随后针对叶片组织和愈伤组织在基因组水平的H3K27me3变化研究表明，PRC2 （polycomb repressive complex 2）介导的H3K27me3是叶片组织向愈伤组织转化所必须的。Li等[16]报道WUSCHEL基因的DNA甲基化和组蛋白修饰对愈伤组织形成茎端分生组织至关重要。损伤同样可以导致拟南芥愈伤组织的形成，但其分子机制与激素诱导形成愈伤组织不同。损伤能够诱导转录因子WIND1（WOUND INDUCED DEDIFFERENTIATION 1）上调表达。过量表达WIND1可以在没有外源激素的情况下增强愈伤组织的形成[17]。尽管陆生植物和后生动物干细胞系统有相似性（图1），但是陆生植物和后生动物重编程的机制是否类似尚不清楚[2-4]。

2 苔藓植物细胞重编程

2.1 模式植物小立碗藓具有很强的重编程能力

小立碗藓是第1个基因组被测序的苔藓植物种，其作为模式植物优点众多，它具有很高的基于同源重组的基因打靶（gene targeting）效率，其单倍体世代（haploid generation）占优势，因而不需要得到纯合植株即可研究其发育过程[18]。茎叶体（gametophore）在原丝体（protonemata）上形成，存在于单倍体世代，由单层细胞的叶片组成。从茎叶体切割已分化的叶片，培养于不含植物激素的培养基中，叶片切口处的细胞会重编程为绿丝体（chloronema）顶端干细胞。基于该重编程体系，可以在细胞水平研究重编程的过程[19]。在拟南芥里，通过分析重编程过程中的转录谱变化，鉴定出一些参与重编程的关键基因，如CDKA （CyclinDependent Kinase A）及WOX13L （WUSCHELrelated homeobox 13like） [19-21]。Wang等[22]和Xiao等[23]分别研究了小立碗藓原生质体重编程为干细胞过程中转录谱和磷酸化蛋白质组的变化。

2.2 进化保守的因子PpCSP1/Lin28参与陆生植物和后生动物的重编程

前期研究发现，小立碗藓PpCSP1（Physcomitrella patens ColdShock Domain Protein 1）蛋白与后生动物中Lin28存在最高的序列相似性以及相同的结构域，并参与陆生植物的重编程（图2，修改自Li等[11]）。

冷激蛋白（coldshock domain protein）能够与单链DNA/RNA或双链DNA结合，在细菌、陆生植物及后生动物中高度保守[24]。Lin28在线虫（Caenorhabditis elegans）中首次被报道，是调控发育时期的异时基因（heterochronic gene）。另一异时基因microRNA let-7能够直接与Lin28的3-UTR區域结合，从而在转录后水平抑制Lin28 [25]。在哺乳动物细胞中，Lin28能够直接抑制let-7转录后调控的成熟过程，而let-7反过来会抑制Lin28自身[26]。除调控干细胞外，过量表达Lin28以及转录因子Oct4、Sox2和Nanog，能够促进人成纤维细胞重编程为具有自我更新能力的iPS细胞[7]。这些研究结果表明，Lin28在多功能干细胞的自我更新中起关键作用。CLIPseq（CrossLinking Immuno Precipitation sequencing）试验表明，RNA结合蛋白Lin28可以结合众多的mRNA，其结合偏好于GGAG或与GGAG类似的基序[27]。异位表达Lin28可以增强小鼠的组织修复能力，该功能是通过Lin28促进其结合的氧化代谢反应相关酶的翻译而调控的，这表明Lin28通过氧化应激代谢网络来调控干细胞的稳态[28]。

前期研究发现，小立碗藓PpCSP1蛋白与其哺乳动物同源蛋白Lin28有着类似的功能，即增强从已分化细胞到干细胞的重编程过程[23]。PpCSP1在原丝体干细胞中积累表达并特异在离体叶片切口处干细胞中富集，表明PpCSP1参与重编程的过程。PpCSP1的表达受其3-UTR负调控，移除3-UTR能够使PpCSP1的转录本更稳定，从而使其转录本和蛋白得到积累，最终增强重编程过程。通过基因打靶技术将小立碗藓基因组中4个PpCSP基因敲除后，4重敲除突变体的重编程过程与野生型相比相对延迟[11]。这些结果表明PpCSP1是小立碗藓中重编程的正调控因子，其功能与哺乳动物iPSC因子Lin28类似。PpCSP1/Lin28作为陆生植物和后生动物调控重编程的共有因子，其发现丰富了对进化-发育（EvoDevo）过程中重编程的理解。

3 展望

重编程是陆生植物和后生动物里非常有趣的现象，其在植物组织培养和干细胞治疗等领域有潜在的应用价值。目前，对陆生植物重编程的分子机制还不清楚。笔者所在团队前期研究发现了一个陆生植物和后生动物调控重编程的共有因子PpCSP1/Lin28。有趣的是，陆生植物和后生动物在单细胞阶段即分开并独立进化，为何存在共有因子来调控重编程、其重编程的调控机制是否也存在共性是未来研究的重要方向。笔者所在团队研究结果提示可能参与PpCSP1调控ROS（reactive oxygen species）水平，而ROS水平的变化可能通过DNA损伤途径来调控重编程。值得注意的是，ROS和DNA损伤广泛存在于生物中，这提示ROS和DNA损伤可能是陆生植物和后生动物中重编程调控的共性之一。未来可以通过研究PpCSP1、ROS、DNA损伤这三者在调控重编程中的关系来阐明PpCSP1调控重编程的分子机制，从而为阐明陆生植物重编程的机理提供理论基础，并与后生动物重編程的分子机制相比较，来进一步理解进化-发育中重编程调控的共性问题。

参考文献

[1]ALVARADO A S，YAMANAKA S.Rethinking differentiation：Stem cells，regeneration，and plasticity[J].Cell，2014，157（1）：110-119.

[2] BIRNBAUM K D，ALVARADO A S.Slicing across kingdoms：Regeneration in plants and animals[J].Cell，2008，132（4）：697-710.

[3] HEIDSTRA R，SABATINI S.Plant and animal stem cells：Similar yet different[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2014，15（5）：301-312.

[4] SUGIMOTO K，GORDON S P，MEYEROWITZ E M.Regeneration in plants and animals：Dedifferentiation，transdifferentiation，or just differentiation？[J].Trends Cell Biol，2011，21（4）：212-218.

[5] TAKAHASHI K，YAMANAKA S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell，2006，126（4）：663-676.

[6] TAKAHASHI K，TANABE K，OHNUKI M，et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors[J].Cell，2007，131（5）：861-872.

[7] YU J，VODYANIK M A，SMUGAOTTO K，et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells[J].Science，2007，318（5858）：1917-1920.

[8] LIU Z H，XIN W，JI D D，et al.GUS activity for miR165a/166b，REV， and WUS/CLV3 in in vitro direct Arabidopsis thaliana shoot regeneration[J].Protoplasma，2013，250（5）：1213-1218.

[9] LUTZ K A，MARTIN C，KHAIRZADA S，et al.Steroidinducible BABY BOOM system for development of fertile Arabidopsis thaliana plants after prolonged tissue culture[J].Plant Cell Rep，2015，34（10）：1849-1856.

[10] WILLIS L，REFAHI Y，WIGHTMAN R，et al.Cell size and growth regulation in the Arabidopsis thalianaapical stem cell niche[J].PNAS，2016，113（51）：8238-8246.

[11] LI C，SAKO Y，IMAI A，et al.A Lin28 homologue reprograms differentiated cells to stem cells in the moss Physcomitrella patens[J].Nat Commun，2017，8：14242.

[12] IKEUCHI M，SUGIMOTO K，IWASE A.Plant callus：Mechanisms of induction and repression[J].Plant cell，2013，25（9）：3159-3173.

[13] STEWARD F C，MAPES M O，MEARS K.Growth and organized development of cultured cells：II.Organization in cultures grown from freely suspended cells[J].Am J Bot，1958，45（10）：705-708.

[14] FAN M Z，XU C Y，XU K，et al.LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN transcription factors direct callus formation in Arabidopsis regeneration[J].Cell Res，2012，22（7）：1169-1180.

[15] HE C S，CHEN X F，HUANG H.Reprogramming of H3K27me3 is critical for acquisition of pluripotency from cultured Arabidopsis tissues[J].Plos Genet，2012，8（8）：1-13.

[16] LI W，LIU H，CHENG Z J，et al.DNA methylation and histone modifications regulate de novo shoot regeneration in Arabidopsis by modulating WUSCHEL expression and auxin signaling[J].Plos Genet.，2011，7（8）：1-12.

[17] IWASE A，MITSUDA N，KOYAMA T，et al.The AP2/ERF transcription factor WIND1 controls cell dedifferentiation in Arabidopsis[J].Curr Biol，2011，21（6）：508-514.

[18] COVE D，BEZANILLA M，HARRIES P，et al.Mosses as model systems for the study of metabolism and development[J].Annu Rev Plant Biol，2006，57（57）：497-520.

[19] ISHIKAWA M，MURATA T，SATO Y，et al.Physcomitrella cyclindependent kinase A links cell cycle reactivation to other cellular changes during reprogramming of leaf cells[J].Plant cell，2011，23（8）：2924-2938.

[20] NISHIYAMA T，MIYAWAKI K，OHSHIMA M，et al.Digital gene expression profiling by 5′end sequencing of cDNAs during reprogramming in the moss Physcomitrella patens[J].Plos one，2012，7（5）：1-13.

[21] SAKAKIBARA K，REISEWITZ P，AOYAMA T，et al.WOX13like genes are required for reprogramming of leaf and protoplast cells into stem cells in the moss Physcomitrella patens[J].Development，2014，141（8）：1660-1670.

[22] WANG X Q，QI M Y，LI J Y，et al.The phosphoproteome in regenerating protoplasts from Physcomitrella patens protonemata shows changes paralleling postembryonic development in higher plants[J].J Exp Bot，2014，65（8）：2093-2106.

[23] XIAO L H，ZHANG L C，YANG G，et al.Transcriptome of protoplasts reprogrammed into stem cells in Physcomitrella patens[J].Plos one，2012，7（4）：1-13.

[24] GRAUMANN P L，MARAHIEL M A.A superfamily of proteins that contain the coldshock domain[J].Trends Biochem Sci，1998，23（8）：286-290.

[25] MOSS E G，LEE R C，AMBROS V.The cold shock domain protein LIN28 controls developmental timing in C.elegans and is regulated by the lin4 RNA[J].Cell，1997，88（5）：637-646.

[26] RYBAK A，FUCHS H，SMIRNOVA L，et al.A feedback loop comprising lin28 and let7 controls prelet7 maturation during neural stemcell commitment[J].Nat Cell Biol，2008，10（8）：987-993.

[27] WILBERT M L，HUELGA S C，KAPELI K，et al.LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance[J].Mol Cell，2012，48（2）：195-206.

[28] SHYHCHANG N，ZHU H，YVANKA DE SOYSA T，et al.Lin28 enhances tissue repair by reprogramming cellular metabolism[J].Cell，2013，155（4）：778-792.