犬肾细胞MDCK研究进展

万玉林 陶世宇 武发菊 柴立丽 安芳兰 杨进才 刘学荣

摘要综述了MDCK细胞的来源、生物学特性及培养方式，旨在为今后MDCK细胞的培养及流感病毒细胞介质疫苗的大规模生产提供理论基础与依据。

关键词MDCK细胞；生物学特性；无血清培养基；微载体；悬浮培养

中图分类号S859.79文献标识码A文章编号0517-6611（2017）23-0096-03

Research Progress on MDCK Cells

WAN Yulin，TAO Shiyu，WU Faju，LIU Xuerong* et al

（Zhongnong Weite Biotechnology Co.，Ltd.，Lanzhou，Gansu 730046）

AbstractThe origin，biological characteristics and culture methods of MDCK cells were reviewed，in order to provide the theoretical basis and foundation for the future culture of MDCK cells and largescale production of the influenza virus vaccine.

Key wordsMDCK cells；Biological characteristics；Serumfree medium；Microcarrier；Suspension culture

基金项目兰州市科技计划项目（2014-1-143）。

作者简介万玉林（1976—），男，甘肃兰州人，硕士，从事口蹄疫疫苗生产与细胞培养工艺研发。*通讯作者，副研究员，从事国家重大动物疫病预防用生物制品技术研发。

收稿日期2017-06-20

自20世纪以来，全球共发生了4次流感大流行，每次流感大流行均严重危害人类和动物的健康，尤其是禽流感极大地威胁了公共卫生安全，给全世界造成了巨大的经济损失。疫苗免疫是预防流感大流行和季节性流行的有效手段。目前的流感疫苗主要是以鸡胚为介质制备的灭活疫苗，但是这种疫苗存在外源因子易污染、培养周期长、生产成本高、操作步骤繁琐、疫苗批次间差异大、鸡胚连续传代病毒时易发生抗原变异且难以大量供应等缺陷[1]。然而，随着国内外大规模细胞培养技术的不断成熟和应用，以细胞为介质的流感病毒疫苗的制备已是必然趋势，其中犬肾（Madin-Darby canine kidney，MDCK）细胞是公认的最佳细胞系[2]。

MDCK细胞系是由Madin等[3]于1958年从美国Cocker Spaniel母曲架犬的肾脏组织分离培育建立而来，其通常是以贴壁方式培养生长的上皮样细胞并能连续传代。目前，MDCK细胞系被广泛用于禽流感病毒、呼肠孤病毒、犬细小病毒、腺病毒及猫粒细胞缺乏症病毒等病毒的分离、扩增和纯化。由于MDCK细胞具有流感病毒易感染、易培养、增殖快及病毒不易变异等特点，被认为是最适合于A型和B型流感病毒疫苗生产的重要细胞系之一[4]。笔者综述了犬肾細胞MDCK的来源、生物学特性及不同的培养方式，旨在为今后MDCK细胞的培养及流感病毒细胞介质疫苗的大规模生产提供理论基础和依据。

1MDCK细胞的来源

最初的MDCK细胞系是从犬的肾脏组织中分离获得的，目前人们可以从美国典型培养物保藏中心（ATCC）、中国典型培养物保藏中心（CCTCC）、中国科学院上海细胞库、北京协和细胞资源中心及武汉大学菌种保藏中心等保藏中心引进MDCK细胞系，扩大培养后用液氮或商品化的冻存培养液冻存后，建立自己的基础种子细胞库。

2MDCK细胞的生物学特性

2.1MDCK细胞的形态

MDCK细胞的来源不同，细胞的形态也不同；MDCK细胞形态一般较为规则，细胞较大，呈梭形或扁平状，或呈多边形，其中央有扁圆形的细胞核。

2.2MDCK细胞的生长特性

MDCK细胞通常以贴壁方式生长并可连续传代，其在细胞方瓶中生长时细胞之间会相互衔接或呈镶嵌状而紧密排列，并会集合形成紧密的连接蛋白分泌到其表面，从而形成单层贴壁细胞。MDCK细胞的生长曲线呈S型，且染色体数目2n=78。当细胞密度在90%以上时，其通常用含0.02%EDTA的0.25%胰酶进行消化，室温一般消化5～10 min，通常按1∶2～1∶4进行传代。

2.3MDCK细胞的冻存和复苏

冻存时MDCK细胞通常用含10%～20%的胎牛或新生牛血清、5%～10%DMSO配制的冻存培养液置于液氮中冻存，并调节冻存液中细胞的终密度为5×106～1×107 cells /mL；复苏时从液氮罐中取出冻存的细胞，直接浸入37 ℃温水中，按照常规方法均能复苏细胞，6 h后待细胞完全贴壁后，换加等量的新鲜营养液，以降低DMSO对细胞的毒性作用。

3MDCK细胞的培养方式

3.1传统培养方式

传统的MDCK细胞培养大多采用有血清的单细胞层贴壁培养[5]。其中的血清由于是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种复杂混合物，含有细胞生长所需的生长因子、载体蛋白、激素、微量元素、贴壁因子以及其他营养物质，能够有效促进细胞的生长和产物的表达，但血清的使用存在一系列问题：易受微生物、病毒和支原体等的污染；批次间的差异易使不同批次病毒疫苗的质量难以严格控制；此外，大量血清蛋白的存在增加了生产疫苗过程中下游分离纯化的难度，部分蛋白难以通过分离纯化被彻底去除，从而影响了产品的最终质量；此外，血清来源困难、价格昂贵，导致大规模动物细胞培养过程中使用血清时大大提高了生产成本。MDCK细胞有血清的贴壁培養目前仅适用于实验室的科研研究。

3.2无血清贴壁培养

近年来，有关MDCK细胞的无血清贴壁培养技术取得了较大进展，适合MDCK细胞贴壁生长的几种商品化无血清培养基相继问世[6-8]。Gibco公司、Hyclone公司和Sigma-Aldrich公司分别研发出EpiSerf、SFM4MegaVir和Ex-Cell MDCK无血清培养基。MDCK细胞无血清培养基是在经优化的基础培养基中添加重组人胰岛素蛋白和牛转铁蛋白的低蛋白含量的成分配制而成。人们通过改变有血清培养基和无血清培养基在MDCK细胞培养过程中的比例，通过无血清贴壁驯化，MDCK细胞可以逐步适应在无血清培养基中生长。研究表明，驯化后无血清贴壁生长的 MDCK细胞贴壁均匀，细胞边缘轮廓模糊，细胞间的结合更加紧密，而在适应前在有血清培养基中贴壁生长的MDCK细胞轮廓清晰，细胞间的结合不如无血清培养的MDCK细胞紧密。此外，在有血清培养基中培养的MDCK细胞很难被胰酶消化，但在其无血清培养基中培养的细胞却很容易被胰酶消化。相关研究也表明，MDCK细胞在无血清培养基中生长时细胞较小并紧密成团，但在无血清贴壁培养过程中细胞的延滞期明显缩短、代谢副产物低、能够更高效地利用培养基中的葡萄糖且能产生较高的细胞密度和比生长速率，对细胞生长有利，与此同时也克服了MDCK细胞在有血清贴壁培养中血清带来的诸多不利因素，但其易受细胞培养基质表面积及无血清培养基的化学成分不明确、价格昂贵等因素的限制，目前无血清贴壁培养也只适用于试验研究，而不适用于MDCK细胞的大规模培养，依然不能满足病毒疫苗等生物制品生产的需要。

3.3微载体悬浮培养

微载体悬浮培养是目前比较先进的贴壁型细胞的培养技术，近年来国内外有许多利用微载体悬浮培养技术培养MDCK细胞生产流感疫苗等生物制品的报道，该技术能使MDCK细胞和流感病毒均大量增殖。

微载体是直径60～250 μm的微珠。微载体本身所占体积不大（如1 g Cytodex 1用PBS水化后体积约为20 mL），但其比表面积很大，从而可以获得较高密度的细胞。目前，微载体种类繁多，适合用于不同特性的细胞株。使用较多的是Cytodex型系列微载体（Cytodex 1、Cytodex 2、Cytodex 3），它们的基质都由葡聚糖交联而成，其上带不同的基团而制成性质不同的3种产品类型。Cytodex 1整个载体带有正电荷，常用于传代细胞（如Vero、CHO细胞）的培养；Cytodex 2仅表面带有正电荷；Cytodex 3不带电荷，其表面被一层胶原包裹，对细胞的贴附具有促进作用，因此更多地被用于无血清培养基微载体培养过程中。MDCK细胞培养使用最多的微载体是Cytodex 1和Cytodex 3。Cytodex 1由阳性二乙氨基乙基基团均匀分布于交联葡聚糖基质上构成，其电荷密度为1.5～2.0 meq/g。1 g Cytodex 1所提供的表面积为4 400 cm2，当浓度为3 g/L时最高细胞密度在4.0×106 cells/mL以上。

采用微载体培养动物细胞，结合了悬浮培养和贴壁培养的优势。在MDCK细胞微载体悬浮培养时为了避免血清今后在疫苗生产过程中给下游纯化工艺带来的不利影响，相关研究人员通过探索培养基中能够促进细胞贴壁的关键成分，并篩选出相关水解物，研发出适合MDCK细胞生长的低血清培养基M-LSM，结果表明，对于贴壁型细胞而言，能贴在其支持物表面是其能够增殖的必要条件，而Ca2+和Mg2+是细胞在低血清培养基中贴壁生长时不可缺少的物质；麦麸水解物可以部分代替培养基中的血清，且不影响MDCK细胞的生长[9]。在此基础上，他们利用该低血清培养基通过微载体悬浮培养技术，经过消化转移等操作实现了MDCK 细胞从5 L反应器至25 L反应器的放大培养，结果表明微载体上细胞贴附均勻、生长旺盛，在25 L反应器中MDCK细胞培养48 h后细胞密度可以达到3.05×106cells /mL，该研究结果为更大体积的反应器大规模地利用微载体悬浮培养MDCK细胞提供了借鉴。另外，进行了微载体浓度优化、接种细胞和微载体比例优化、搅拌速度和搅拌方式优化、换液策略优化等培养工艺的研究，推动了MDCK细胞微载体悬浮培养的产业化生产。

3.4单细胞悬浮驯化培养

MDCK细胞大规模培养常因其必须贴附生长而受到限制，前几年较大规模的MDCK细胞生产流感疫苗常用微载体作为载体，支持MDCK细胞贴附生长。虽然微载体悬浮培养能使MDCK细胞获得较高的细胞密度，但其消化过程复杂，从而增加了生产时间与生产成本，且步骤繁琐。然而，单细胞悬浮培养不受细胞生长表面基质的限制，易实现MDCK细胞的大规模生产。相关研究表明，可以通过直接法和间接法驯化MDCK细胞，使之在特定的细胞培养液单细胞悬浮培养。悬浮驯化的MDCK细胞经逐级放大培养后，以之作为载体介质可以制备出有效、安全和高产量的流感病毒疫苗。

在MDCK细胞单细胞悬浮培养驯化前，首先应使其适应在某种成分已知的无血清培养液中培养，此过程通过直接法和间接法驯化可以实现。直接法为完全替换培养液，21 d左右细胞生长速度即可恢复；间接法为逐步替换培养液，即改变有血清和无血清培养液的混合比例，用时2个月甚至更长[10]，细胞能适应无血清培养液。然后，将适应无血清培养液的MDCK细胞，按约0.5×106cells/mL的密度接种至250 mL锥形瓶中，培养体积约60 mL，在细胞培养箱中37 ℃恒温下振荡培养。为了避免细胞大量死亡，起始转速设为30 r/min。驯化期间每天观察MDCK细胞的生长情况，并使用测糖仪定期测定培养液中葡萄糖的含量，当培养液中葡萄糖含量低于1.0 mg/mL时立即更换培养液。随着细胞数量的不断增加，培养转速也要逐渐增大，从30 r/min可变为45 r/min直至60 r/min，防止细胞结团。相关研究表明，通过直接法和间接法驯化，适应了无血清培养液的MDCK细胞经进一步驯化后均能实现单细胞的悬浮培养，但直接法省时省力，间接法驯化周期较长。

相關研究也表明，单细胞悬浮驯化培养可通过硅化方瓶-摇床体系来实现。具体方法如下：为了阻止MDCK细胞贴壁，首先用硅化剂处理方瓶的表面；其次，通过调整无血清培养基的组分及浓度并不断对其优化，以便其能够支持因硅化而未能贴壁的细胞增殖。先让MDCK细胞在优化后的培养基中静止培养数小时后，再将细胞全部转移至未经处理的方瓶中，在摇床上悬浮振荡培养，设定转速为60 r/min，在此期间前几次不传代，只换营养液，以保证足够多的细胞，重复几次后再将细胞上清中的悬浮细胞转入硅化剂处理过的方瓶中，同样置于摇床上悬浮振荡培养，起初每48 h更换新鲜的营养液但不分传，直至细胞的比生长速率趋于稳定后，每次按约3.0×105 cells/mL的密度进行传代培养，如此循坏往复将贴壁的MDCK细胞实现单细胞悬浮培养，并能稳定增殖。

相关研究表明，与有血清和无血清贴壁培养方式相比，无血清单细胞悬浮培养的MDCK细胞的延滞期大大缩短，葡萄糖比消耗速率也大幅度降低，生成代谢的副产物较少，细胞比生长率较高，活细胞密度和细胞活力进一步提高，其中无血清单细胞悬浮培养其最大细胞密度是有血清贴壁培养方式的3.6倍，这表明无血清单细胞悬浮培养更有利于MDCK细胞更高密度的生长和规模生产，能有效解决和避免大规模培养MDCK细胞过程中存在的诸多问题。

4结语

传统的流感灭活疫苗均是利用9～11日龄的非免疫鸡胚制备的，然而此种方法存在许多不足，如缺乏可靠的鸡胚来源、繁琐的操作步骤、较高的生产成本 、疫苗批次间较大的差异以及易污染等[11]。随着国内外大规模动物细胞培养技术的不断成熟与发展，再加上MDCK细胞本身培养容易、流感病毒易感染、增殖快及病毒不易变异等特点，于是以MDCK细胞为介质代替鸡胚来生产流感疫苗是最佳方式。目前，已有MDCK细胞生产的流感疫苗相继问世。

迄今为止，大规模的MDCK细胞生产流感疫苗主要利用微载体悬浮培养和单细胞悬浮培养方式，其培养过程中主要使用无血清培养基。无血清培养过程可以限制和避免血清带来的诸多不足，尤其是单细胞无血清悬浮培养方式由于具有细胞比生长率较高、能使细胞达到较高的密度和活力及代谢副产物少等优点，因此其更有利于MDCK细胞高密度的培养和大规模生产，更有利于培养和扩增过程的优化和放大，并能支持流感病毒的复制及获得较高的滴度，对大规模悬浮培养MDCK细胞增殖流感病毒及制备安全、有效、高质量和高产量的流感疫苗具有重要的应用价值，同时也为利用其他动物细胞来大规模生产病毒疫苗等生物制品提供了依据和借鉴。

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