防治西瓜枯萎病的微生物菌种的筛选与鉴定

陈允亮 毛慧渊 陶黎明

摘要 [目的]对一组防治西瓜枯萎病的微生物菌种进行鉴定。[方法]以西瓜专化型尖孢镰刀菌为研究对象，从海洋海绵共生菌和土壤样品中筛选到6株具显著拮抗西瓜专化型尖孢鐮刀菌的活性菌株，并对该6株活性菌株进行分子鉴定。[结果]分子鉴定显示该6株活性菌株均属于芽孢杆菌属的物种。[结论]试验结果为西瓜枯萎病类安全高效的生物农药及功能型生物肥料的创制提供了理论依据。

关键词 枯萎病；生物防治；尖孢镰刀菌；芽孢杆菌

中图分类号 S436.5 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）28-0011-03

Abstract [Objective] The aim was to identify microorganism against watermelon Fusarium wilt.[Method] The Fusarium oxysporum f.sp.niveum was taken as the research object and six strains with significant antagonistic activity to Fusarium oxysporum f.sp.niveum from symbiotic bacteria of marine sponges and soil samples were screened， and the six active strains was identified through molecular biological characterization.[Result] The molecular biological characterization showed that these six active strains all belonged to Bacillus.[Conclusion] The conclusion of this study lays a foundation for new type of safe and efficient biological pesticide and functional biological fertilizer towards watermelon wilt.

Key words Wilt；Biological control；Fusarium oxysporum；Bacillus

西瓜是我国重要的经济作物，其种植面积和产量均居世界第一位[1-2]。西瓜汁液含有丰富的矿物盐、糖分、水分和多种维生素，成为夏季消费佳品，栽培西瓜具有较高的经济效益和生态效益。因此，近年来西瓜生产发展迅速，但由于连作重茬，病害日益严重，也称之为“连作障碍”，并已成为西瓜生产的重要制约因素[2]。西瓜枯萎病是一种严重的真菌病害，可以造成植株大面积死亡，产量减少（减产15%以上），品质下降（含糖量降低），其病原为尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）[3-4]。西瓜枯萎病是一种土传病害，在世界范围内广泛发生[5]。以浙江、上海地区的西瓜种植为例，瓜农为避免连作障碍的发生，需要每年更换西瓜种植土地，进行轮作，这在当前我国耕地越来越稀缺的背景下，极大地增加了瓜农的用地成本及生产资料搬迁带来的额外劳动负担。笔者以西瓜枯萎病的致病菌（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）作为研究对象，从海洋海绵共生菌和土壤样品中筛选到多株具有显著拮抗Fusarium oxysporum f.sp.niveum的6株活性菌株，并进行了16S-rDNA分子鉴定，以期为西瓜枯萎病类安全高效的生物农药及功能型生物肥料的创制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株。

尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）由江蘇大学环境学院戴志聪博士提供，尖孢镰刀菌西瓜专化型拮抗菌株由华东理工大学药学院陶黎明教授提供。

1.1.2 培养基。

受试菌种子培养基选择LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL。

尖孢镰刀菌种子培养基选择肉汤培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏15 g，氯化钠15 g，蒸馏水1 000 mL，调节pH 7.2。

拮抗试验培养基选择肉汤琼脂培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏15 g，氯化钠15 g，蒸馏水1 000 mL，琼脂18 g，调节pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养与拮抗试验。

将受试菌和尖孢镰刀菌种子分别划线到肉汤琼脂培养基平板表面，30 ℃过夜培养12 h以上；挑取受试菌单菌落于液体LB培养基中，30 ℃过夜振荡培养，挑取尖孢镰刀菌单菌落于肉汤琼脂培养基中，30 ℃过夜振荡培养。次日分别吸取受试菌和尖孢镰刀菌菌液各30 μL滴加于肉汤琼脂培养基平板两侧，待平板吹干后，置于30 ℃培养箱中继续培养2～3 d，观测拮抗效果。

1.2.2 菌种鉴定。

将筛选到的拮抗活性菌株分别提取DNA，以16S-rDNA/18S-rDNA/26S-rDNA D1/D2区的序列引物对上述基因组DNA进行PCR扩增，将扩增到的DNA片段连接至pMD18-T Vector载体，转化大肠杆菌，获得阳性克隆后送上海生工进行测序。利用NCBI数据库Blast程序对测序获得的序列进行同源性检索，与GenBank数据进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 尖孢镰刀菌西瓜专化型拮抗菌株的筛选

利用肉汤琼脂培养基平板共培养方法，从海洋海绵共生菌和土壤样品中初步筛选到具有明显拮抗活性的菌株共6株，分别标记为S2036NH14-2、S2037NH17-3、S2038NH7-6、S2039NH11-1、S20405-1 B1和S20414-27-1。将上述6株活性菌株和尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株进一步共培养于同一块肉汤琼脂培养基平板，其拮抗效果见图1。

2.2 菌種鉴定

当以细菌的16S-rDNA引物27F（AGTTTGATCMTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）對上述6株拮抗菌株的基因组DNA进行PCR扩增时能够扩增到1.3～1.5 kb的特征性条带（图2），进一步将上述条带克隆至pMD18-T Vector，随后对阳性克隆进行测序，根据测序获得的序列与NCBI数据库进行序列比对，各菌株鉴定结果见表1。

3 结论与讨论

该研究以西瓜专化型尖孢镰刀菌为研究对象，从不同来源样本（海洋海绵共生菌及土壤样品）中筛选其拮抗菌株，对其进行分子鉴定，结果显示6株拮抗菌株分别为芽孢杆菌属的Bacillus velezensis、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。国内外将芽孢杆菌应用于生物防治已有60多年的历史。1945年Johnson等[6]报道，枯草芽孢杆菌具有防治植物病害的作用。此后，用枯草芽孢杆菌制备生防制剂防治植物病害的研究成为国内外研究的热点。Lewis等[7]报道，枯草芽孢杆菌可以防治水稻等作物的多种土传真菌病害。Lee等[8]报道，用枯草芽孢杆菌可以防治豌豆的 Rhizoctoni根腐病害。20世纪 90 年代后，国外已有多种枯草芽孢杆菌制剂投放市场。

进入21世纪后，随着微生物分子生物学研究方法的革新、基因组测序技术的快速发展，越来越多的芽孢杆菌全基因组序列予以公布，在此基础上研究人员在芽孢杆菌中分析鉴定到近20种天然产物生物合成基因簇及其代谢产物，主要包括脂肽类、聚酮类（PKS）、羊毛硫肽类、硫肽类等。Schneider等[9]、Liu等[10]在解淀粉芽孢杆菌中继bacillaene和difficidin后鉴定了新的Polyketide天然产物Macrolactin的生物合成途径及其化学结构（图3）。Luo等[11]研究表明，枯草芽孢杆菌916中除了产生传统的脂肽类天然

产物如表面活性素（surfactins）、bacillomycin Ls（iturins伊枯草菌素家族）和（泛革素）fengycins，还可产生一类称之为locillomycins新的脂肽类化合物（图4），并对其生物合成基因簇进行了比较（图5）。Qin等[12]通过对解淀粉芽孢杆菌L-S60的全基因组测序发现，L-S60除了产生传统的surfactin、iturin和 fengycins类脂肽，还在其基因组中发现了一些促进生长荷尔蒙分泌、生物膜形成和挥发性化合物产生的相关基因。Chen等[13]从青藏高原牦牛粪便中分离到生防菌Bacillus velezensis LM2303，并对其基因组进行全测序，通过序列分析发现，Bacillus velezensis LM2303基因组除了编码Iturin、Fengycin和 surfactin的NRPS（nonribosomal peptide synthetases）传统生物合成基因外，还包括一些新的如硫肽类Kijanimicin的生物合成基因等（表2）。

综上，该研究筛选到的6株拮抗西瓜枯萎病致病菌的活性菌株皆属于芽孢杆菌属，有其必然性，芽孢杆菌丰富的次级代谢产物生物合成能力是其强大抗真菌活性的根本保证。

该研究结论较好地印证了此前诸多关于芽孢杆菌可用于生物防治及其生防机制的相关报道，也为新型、环境友好的生物农药及功能型（抗病）生物肥料的创制奠定了基础。

参考文献

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