野火球总黄酮提取及抗氧化研究

姜守刚 袁颖洁 阮鑫

摘要 [目的]优化野火球总黄酮的最佳提取工艺，研究野火球总黄酮的抗氧化活性。[方法]比较分析热回流提取法、索氏提取法、超声提取法对野火球总黄酮提取率的影响，并采用单因素试验及正交设计试验，优化超声提取野火球总黄酮的最佳提取工艺。采用DPPH和FRAP法对野火球总黄酮的DPPH自由基清除能力和总抗氧化活性进行评价。[结果]超声提取法为提取野火球总黄酮的最合适的提取方法，其最优工艺参数是：乙醇浓度50%，超声时间75 min，料液比1∶20，超声功率350 W。在上述条件下，野火球总黄酮提取率为1.686%。野火球提取物对DPPH自由基有较好的清除效果，IC50为（0.207 7±0.010 3） mg/mL，并且具有较好的总抗氧化能力，FRAP值为（4.561 0±0.228 0） mmol/g。[结论]优化的野火球总黄酮提取工艺稳定可行，野火球总黄酮具有較好的抗氧化活性。

关键词 野火球；总黄酮；超声提取；正交试验；抗氧化

中图分类号 R284.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）28-0003-04

Abstract [Objective] To optimize the extraction process for total flavonoids from Trifolium lupinaster L.and to study its antioxidant activities.[Method] Choosing the extraction rate of flavonoids as evaluation standard，the different methods，such as heating reflux method，soxhlet extration method and ultrasonic extraction，were comparatively analysed.Base on the single factor tests and the orthogonal experimental design，the best condition of ultrasonic extraction flavonoids was found and sifted.Furthermore，the DPPH radical scavenging capacity and FRAP total antioxidant activity tests were carried out to examine its antioxidant activities.[Result] The ultrasonic extraction was the best way to extract the total flavonoids from Trifolium lupinaster L.The optimal ultrasonic extract conditions were ethanol concentration of 50%，ultrasonic time of 75 min，solidliquid radio of 1∶20 and ultrasonic power of 350 W.Under these optimized conditions，the yield of total flavonoids from Trifolium lupnaster L.was 1.686%.Additionally，by in vitro antioxidant assays，the total flavonoids extracted using ultrasonic extraction had a potent scavenging effect on DPPH free radical with IC50 value of （0.207 7±0.010 3） mg/mL and FRAP antioxidative capacity scavenging activity with value of （4.561 0±0.228 0） mmol/g.[Conclusion] The ultrasonic extraction of total flavonoids was stable and feasible.Moreover，the extracts by this method exhibited a better antioxidative activity.

Key words Trifolium lupinaster L.；Total flavonoids；Ultrasonic extraction；Orthogonal experiment；Antioxidant activity

野火球（Trifolium lupinaster L.）为豆科车轴草属多年生草本植物，别名野车轴草、豆参、野火萩等。野火球大多数生长在林缘草甸、森林草原、山坡湿地、河岸两旁、灌丛中，广泛分布于我国黑龙江省、辽宁省、吉林省、内蒙古和河北省等地[1]。据记载，野火球味苦、性平，具有镇静安神、止咳止血的功效[2]。

研究表明，野火球中含有丰富的黄酮类成分[1]。国外对野火球的研究很少，国内有对其化学成分[1]、镇静催眠[3]、营养价值[4]、总黄酮微波提取优化[2]、组织培养[5-6]等方面的研究，而对野火球总黄酮不同提取方法的比较研究和抗氧化活性研究鲜见报道。因此，野火球作为一种可再生资源，对其进行进一步的开发和利用具有重要意义。

热回流提取法可以使提取剂与目标物充分接触，并通过升温来提高溶剂对目标物的提取率[7]。索氏提取法是利用溶剂回流及虹吸原理，使用纯溶剂不断地萃取固体物质的一种提取方法[8]。超声提取法的原理是利用超声波的空化作用、热效应和机械效应，使胞内有效成分不断地被释放、扩散和溶解，进而使有效成分的提取率得到显著提高[9]。笔者以野火球总黄酮提取率作为考察指标，研究了在相同提取条件下3种不同提取方法（热回流提取法、索氏提取法、超声提取法）对野火球总黄酮提取率的影响，采用单因素试验及正交设计试验优化超声提取的最佳提取工艺，并对野火球总黄酮的DPPH自由基清除能力和FRAP抗氧化能力进行了分析[10]，以期为野火球的综合開发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料。野火球采自黑龙江省哈尔滨市东北林业大学知园，经东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室祖元刚教授鉴定为豆科植物野火球（Trifolium lupinaster L.）。将野火球药材洗净后干燥，粉碎，然后过80目筛，将其置阴凉干燥处以待备用。

1.1.2 药剂与试剂。芦丁标准品购自南京泽朗医药科技有限公司；FRAP购自碧云天生物技术有限公司；DPPH购自美国Sigma公司； 亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝和乙醇均为分析，购自天津市天力化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器。KQ-500DE超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司；DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱热购自上海一恒科學仪器有限公司；FW100高速万能粉碎机购自天津泰斯特仪器有限公司； ALC-1104电子分析天平购自北京赛利多斯仪器系统有限公司；752N紫外可见分光光度计购自上海精密科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 芦丁标准工作曲线的绘制。

称取0.101 2 g芦丁标准品（120 ℃烘干至质量恒定），用60%乙醇溶解，然后置于100 mL容量瓶中，定容至100 mL，所配制芦丁标准溶液的浓度为1.012 mg/mL。

精密移取0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL芦丁标准溶液，分别置于10 mL容量瓶中，加蒸馏水至2.4 mL，加0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，混匀，放置6 min；加0.3 mL10%硝酸铝溶液，混匀，放置6 min；加4.0 mL 4.3%氢氧化钠溶液，再加入蒸馏水定容至10.0 mL，混匀，放置15 min，以试剂空白为参比，在波长490～520 nm扫描，得到其最大吸收峰的波长是515 nm，以吸光度为纵坐标（y），芦丁标准溶液浓度为横坐标（x）绘制芦丁标准曲线，得到回归方程：y=9.456 5x+0.000 8，R2=0.999 5。

1.2.2 野火球总黄酮提取率的测定。称取1.000 3 g野火球粉末，在一定的乙醇浓度、温度和料液比条件下提取，并对提取液进行抽滤、离心和定容。精密移取一定量的待测液，并且按照“1.2.1”方法测定吸光度，得到总黄酮含量，再由公式（1）计算总黄酮提取率：

总黄酮提取率=X×V×V′m×103×100%（1）

式（1）中，X为根据标准曲线计算出的芦丁浓度（mg/mL）；V为待测液的定容总体积（mL）；V′为提取后过滤得到的体积与待测液定容总体积之比；m为野火球粉末质量（g）。

1.2.3 野火球总黄酮的提取。

1.2.3.1 热回流提取法。

称取1.000 2 g野火球粉末置于热回流装置中，按照料液比1∶20共加入80 mL 50%乙醇，温度60 ℃，提取时间60 min，冷却并对提取液进行抽滤、离心和定容。精密移取一定量待测液，按照“1.2.1”方法测定吸光度。

1.2.3.2 索氏提取法。

称取1.000 4 g野火球粉末置于索氏提取装置中，按照料液比1∶20共加入80 mL 50%的乙醇，温度60 ℃，提取时间60 min，冷却并对提取液进行抽滤、离心和定容。精密移取一定量待测液，按照“1.2.1”方法测定吸光度。

1.2.3.3 超声提取法。

称取1.000 3 g野火球粉末置于带塞锥形瓶中，按照料液比1∶20共加入80 mL 50%乙醇，60 ℃下提取60 min，冷却并对提取液进行抽滤、离心和定容。精密移取一定量待测液，按照“1.2.1”方法测定吸光度。

1.2.4 單因素试验。

1.2.4.1 乙醇浓度的选择。

称取6份1.000 3 g野火球粉末，放入带塞锥形瓶中，按料液比1∶20分别加入不同浓度（10%、30%、50%、70%、90%）乙醇。设置超声功率300 W，温度恒定于60 ℃，然后将其在上述条件下提取60 min，冷却并对提取液进行抽滤、离心和定容。精密移取一定量待测液，按照“1.2.1”方法测定吸光度。

1.2.4.2 超声时间的选择。称取6份2.000 7 g野火球粉末，放入带塞锥形瓶中，按料液比1∶20，加入50%乙醇。设置超声功率300 W，温度恒定于60 ℃，然后选择不同的超声时间（30、45、60、75、90 min），将其在上述条件下进行提取，提取之后冷却提取液，并且进行抽滤、离心和定容。精密移取一定量待测液，按照“1.2.1”方法测定吸光度。

1.2.4.3 料液比的选择。

称取6份2.000 1 g野火球粉末，放入带塞锥形瓶中，加入50%乙醇，超声时间60 min，超声功率300 W，温度恒定于60 ℃，然后选择不同的料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30），将其在上述条件下进行提取，冷却提取液，并且进行抽滤、离心和定容。精密移取一定量待测液，按照“1.2.1”方法测定吸光度。

1.2.4.4 超声功率的选择。

称取6份2.000 2 g野火球粉末，放入带塞锥形瓶中，按料液比1∶20，加入50%乙醇，超声时间60 min。温度恒定于60 ℃，然后选择不同的超声功率（200、250、300、350、400 W），将其在上述条件下进行提取，提取之后冷却提取液，并且进行抽滤、离心和定容。精密移取一定量待测液，按照“1.2.1”方法测定吸光度。

1.2.5 正交试验。

在单因素试验的基础上，以乙醇浓度、超声时间、料液比和超声功率4个因素的3个水平（表1）进行正交试验，优化超声提取野火球总黄酮的工艺条件，建立L9（34）正交表。

1.2.6 野火球总黄酮抗氧化活性的测定。

1.2.6.1 清除DPPH自由基能力的测定。

称取0.003 9 g DPPH，将其溶解于95%乙醇溶液中[11]，并用100 mL容量瓶定容，配制成0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液，置于暗处保存[12]。向试管中分别加入1.5 mL 0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液和1.5 mL不同浓度的样品溶液，混合，振荡，在室温和避光条件下使其反应30 min，然后在517 nm波長处测定吸光值[10]。以空白试剂作为对照，DPPH自由基清除率按照公式（2）进行计算：

清除率=A0-A1A0×100%（2）

式（2）中，A0为 DPPH 与乙醇混合液的吸光度；A1为加入样品后 DPPH 与乙醇混合液的吸光度。

1.2.6.2 FRAP总抗氧化能力的测定。

准确吸取乙酸缓冲液、TPTZ溶液和三氯化铁溶液各2.5 mL，并将上述混合液置于37 ℃下保温30 min[13]。取300 μL不同浓度的样品溶液和6 mL FRAP溶液混合，振荡，37 ℃避光保温30 min，在593 nm波长处测定吸光值[14]。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法的比较

热回流提取法、索氏提取法、超声提取法对野火球总黄酮提取率影响结果如图1所示，在相同提取条件下（料液比1∶20、乙醇浓度50%、提取温度60 ℃、提取时间60 min）野火球超声提取物中总黄酮含量高于热回流提取法和索氏提取法，这可能是由于超声波具有机械效应、空化效应和热效应等作用，可以增大介质分子的运动速度同时也增强了介质的穿透力，所以加速了野火球中总黄酮的扩散和溶解，同时也减少了其他杂质成分的溶出量[9]。热回流提取法和索氏提取法的提取率低于超声提取法，因此，选取超声提取法提取野火球中总黄酮成分，并采用单因素试验及正交试验优化超声提取的最佳提取工艺。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇浓度对野火球总黄酮提取率的影响。

由图2可知，随着乙醇浓度增加野火球总黄酮的提取率有所提高，当乙醇浓度为50%时，野火球总黄酮的提取率达到最大值，但是之后随着乙醇浓度的增大野火球总黄酮的提取率逐渐减小。这可能是因为随着乙醇浓度的增大，材料细胞的溶胀性增强，乙醇溶液向细胞内部渗透增强，有效地增大了黄酮的溶出量，当乙醇浓度继续增大，溶剂极性越来越低，具有亲水性的黄酮溶出量减少，野火球总黄酮提取率下降[15]。因此，在其他条件确定时乙醇最佳浓度为50%，并且选取乙醇浓度30%、50%和70%作为正交试验的条件。

2.2.2 超声时间对野火球总黄酮提取率的影响。

由图3可知，在超声时间逐渐增加的过程中，野火球总黄酮的提取率呈现出逐渐增大的趋势，并且当超声时间为60 min时，野火球总黄酮的提取率达到最大值，之后有减小的趋势，这可能是因为当超声时间达到60 min时大部分黄酮类物质已溶出，当超声时间继续延长时，有可能溶出了其他杂质或分解了部分黄酮类物质，导致野火球总黄酮提取率下降[9]。因此，在其他条件确定的情况下，最合适的超声时间为60 min，并且选取超声时间45、60和75 min作为正交试验的条件。

2.2.3 料液比对野火球总黄酮提取率的影响。

由图4可知，在料液比逐渐增大的过程中，野火球总黄酮的提取率逐渐减小，当料液比为1∶10时，野火球总黄酮的提取率达到最大值，之后稳定减小至基本不变，这可能是因为在料液比1∶10时，黄酮类成分已基本溶出，继续增加溶剂用量反而促使其他杂质的溶出，导致野火球总黄酮的提取率减小[12]。考虑到节约成本和后续回收操作，因此在其他条件确定的情况下，最佳料液比为1∶10，并且选取料液比1∶10、1∶15和1∶20作为正交试验的条件。

2.2.4 超声功率对野火球总黄酮提取率的影响。

由图5可知，在超声功率逐渐增加的过程中，野火球总黄酮提取率呈现出逐渐增大的趋势，当超声功率增加到350 W时，野火球总黄酮提取率达到最大值，之后有减小的趋势，这可能是由于超声波的机械效应和空化作用更容易使细胞膜被破坏，进而使大部分存在于膜内的黄酮类成分更容易溶出，当超声功率达到350 W时，随着超声功率的增大，分子之间的运动更加剧烈，加强了黄酮类成分和其他成分之间的反应，从而使黄酮类成分遭到破坏，导致野火球总黄酮的提取率减小[16]。因此在其他条件确定的情况下，最佳超声功率为350 W，并且选取300、350和400 W作为正交试验的超声功率。

2.3 正交试验结果

由表2极差分析可知，影响野火球总黄酮提取率的4个因素从主到次顺序为A（乙醇浓度）、C（料液比）、B（超声时间）、D（超声功率）。方差分析结果表明，乙醇浓度对野火球总黄酮提取率的影响为极顯著，料液比对野火球总黄酮提取率的影响为显著。正交试验设计得出最佳提取工艺条件组合为A2B3C3D2，即乙醇浓度50%，超声时间75 min，料液比1∶20，超声功率350 W。在上述条件下，超声提取得到的野火球总黄酮提取率为1.686%。

2.4 野火球总黄酮抗氧化活性分析

2.4.1 DPPH自由基清除能力。

由图6可知，3种不同的提取方法（热回流提取法、索氏提取法和超声提取法）得到的野火球提取物对DPPH自由基都有一定的清除效果，并且浓度在0.012 5～0.400 0 mg/mL，当野火球提取物浓度逐渐增大时，其对DPPH自由基清除效果越明显，可以看出二者具有一定的量效关系。当浓度在0.400 0～0.800 0 mg/mL时，不同提取方法得到的提取物的清除率变化不大，且趋于一致。

热回流、索氏提取和超声提取得到的野火球提取物对DPPH自由基清除能力的IC50值分别为（0.207 7±0.010 3）、（0.253 1±0.012 7）、（0.318 6±0.015 9） mg/mL。由此可见，不同提取方法（热回流提取法、索氏提取法和超声提取法）获得的野火球提取物对DPPH自由基清除能力从大到小依次为超声提取物、索氏提取物、热回流提取物，因此，超声提取物对DPPH自由基具有较好的清除效果。

2.4.2 FRAP抗氧化能力。

FRAP作为一种检测被测物质抗氧化能力的简单直接的常规方法被广泛应用。该研究采用FRAP法研究不同提取方法得到的野火球提取物的抗氧化活性。由图7可知，3种提取方法得到的野火球提取物的抗氧化能力从大到小依次为超声提取物、索氏提取物、热回流提取物，表明超声提取野火球中抗氧化活性成分的效果最好，索氏提取次之，热回流提取最差。

3 结论

不同的提取方法影响野火球总黄酮成分的提取。试验以野火球为原料，以野火球总黄酮提取率作为考察指标，分别采用热回流提取法、索氏提取法和超声提取法提取野火球总黄酮。通过3种提取方法的比较得出超声提取方法的提取率最高，并且其具有高效、经济等优势。采用单因素试验及正交设计试验优化超声提取野火球总黄酮的最优工艺。野火球总黄酮超声提取最优工艺参数为：乙醇浓度50%，超声时间75 min，料液比1∶20，超声功率350 W。在上述条件下，超声提取得到的野火球总黄酮的提取率為1.686%。

对野火球提取物的抗氧化活性的研究表明，超聲提取得到的提取物具有较热回流提取法和索氏提取法更好的DPPH自由基的清除能力和FRAP抗氧化能力。试验结果为野火

球的进一步开发和利用提供了理论依据。

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