茶树炭疽病病原鉴定

刘威 袁丁 郭桂义 杨国一 叶乃兴

摘要：【目的】明确福建省福州市茶树炭疽病病原菌种类，为茶树炭疽病的防治及抗病育种提供参考。【方法】采用形态学结合基于谷氨酰胺合成酶（GS）、β-微管蛋白（β-TUB2）、核糖体DNA内转录间隔区（rDNA-ITS）和核糖体DNA大亚基（LSU）等4个基因序列的多基因系统发育分析方法，对从福州市几个茶园不同茶树品种炭疽病典型病叶上分离获得的茶树炭疽病病原菌（FFB、FJG、FRG、FSX和FFA）进行鉴定，并利用柯赫氏法则验证菌株的致病性。【结果】5株供试病原菌均能通过伤口侵染茶树叶片，且病症相似，为茶树炭疽病致病菌。5株病原菌分离物形态特征相似，基于多基因系统发育分析并结合其形态学特征，将5株供试菌株鉴定为Colletotrichum siamense。【结论】C. siamense为茶树炭疽病弱致病菌，主要通过伤口侵染茶树。生产中应尽量避免人为活动造成茶树叶片损伤，以减少茶树发生炭疽病。

关键词： 茶树；炭疽病菌；鉴定；致病性测定；多基因系统发育分析

中图分类号： S435.711 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）03-0448-06

0 引言

【研究意义】茶树原产于我国，种植与利用历史悠久，其叶片富含茶多酚、氨基酸、生物碱等具有保健功效的化学成分（宛晓春，2014；徐欢欢等，2016），已得到全世界人们的认可。随着茶叶需求量的增加，茶园面积不断扩大，加上部分茶区茶树品种单一，管理粗放，使得茶树病害日益加重（李向阳等，2016）。茶树炭疽病是危害茶树生长的主要病害之一，全国各茶区均有发生，影响茶树种植与茶叶生产，造成茶叶产量及品质下降（谭济才，2011）。炭疽病致病菌种类繁多，种内存在较多生理小种，地理分布和寄主范围均非常广泛，且不同小种间生物学特性及致病力也存在差异（Hyde et al.，2009）。近年来，福建省福州市茶园茶树炭疽病病害发生较严重，而茶树炭疽病致病菌种类仍未明确，因此，开展福州市茶树炭疽病致病菌鉴定及病原致病性研究对于当地茶园茶树炭疽病病害防治具有重要意义。【前人研究进展】形态学特征和寄主范围是区别炭疽菌种间关系的重要依据。陈宗懋和陈雪芬（1990）、陆家云（1997）采用传统鉴定手段发现能侵染茶树的炭疽病致病菌有Colletotrichum camelliae和C. crassipes。刘威等（2014， 2015）采用形态学结合分子生物学的方法将能侵染茶树引起炭疽病的致病菌鉴定为C. camelliae、C. fructicola和C. gloeosporioide。王玉春等（2015）采用系统发育学和形态学相结合的方法对我国15省（市、区）部分茶區茶树炭疽病病叶进行病原菌鉴定，基本明确C. camelliae为我国茶树炭疽菌优势种。Liu等（2015）从贵州、河南、江西、四川、云南、福建和浙江等7个省茶树上分离炭疽病病原菌，经鉴定获得6种茶树炭疽病病原菌，并推测C. camelliae是我国山茶属植物的主要危害种。【本研究切入点】前人对福建省茶树炭疽病菌鉴定的取样点仅为泉州、漳州等福建东南沿海地区，福州地区茶树炭疽病致病菌鉴定研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】对福州市几个茶园茶树炭疽病病原菌进行分离、纯化，采用形态学结合基于谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）、β-微管蛋白（β-tubulin， β-TUB2）、核糖体DNA内转录间隔区（Ribosomal internal transcribed spacer，ITS）和核糖体DNA大亚基（Ribosomal RNA large subunit gene，LSU）等4个基因序列的多基因系统发育学分析方法对获得的茶树炭疽病病原菌进行鉴定，明确其病原种类、遗传多样性及致病性特点，以期为茶树炭疽病的综合防治及抗病育种提供参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

分别于2015年6～9月从福建省福州市福建农林大学茶园（包括南山茶园、茶叶经济与科技实验室茶园）茶树上采集不同茶树品种炭疽病典型病叶标本，利用组织分离法从病叶上分离病原菌，经单孢分离获得纯培养菌株，并通过接种测定确认为茶树炭疽病致病菌，编号为FFB、FJG、FRG、FSX和FFA，5株病原菌的寄主分别为福鼎大白茶、金观音、肉桂、水仙和福安大白茶。5株菌株均用马铃薯蔗糖琼脂（PSA）培养基保存于4 ℃冰箱内备用。

PSA培养基：马铃薯200 g、蔗糖20 g、硝酸钾（KNO3）8 g、琼脂粉3 g和水1000 mL，高压蒸汽灭菌锅中121 ℃灭菌30 min。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 茶树炭疽病菌形态学性状 参考刘威等（2014）的方法进行各菌株纯培养特性、菌落生长速度、分生孢子及分生孢子附着孢的形态、大小、色泽观察。

1. 2. 2 茶树炭疽病菌致病性测定 采用柯赫氏法则测定各菌株致病力。将供试病原菌FFB、FJG、FRG、FSX和FFA分别接种至PSA培养基上，26 ℃下培养至产生孢子，将分生孢子用无菌水制成悬液，用分生孢子悬液对已消毒的无菌茶树当年生成叶进行有伤口和无伤口接种，将接种后的茶树叶片置于人工气候箱中保湿培养，8 d后测定病斑直径，根据病斑直径判断菌株的致病力（刘威等，2014）。

1. 2. 3 菌丝DNA提取及PCR扩增 从供试菌落上收集菌丝，加液氮研磨粉碎后参考Chen等（2007）的方法进行菌丝基因组DNA抽取。采用引物对Bt2a/Bt2b（5'-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3'/5'-ACCC

TCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'）、ITS1/ITS4（5'-TC

CGTAGGTGAACCTGCGG-3'/5'-TCCTCCGCTTATT

GATATGC-3'）、GSF1/GSR1（5'-ATGGCCGAGTACAT

CTGG-3'/ 5'-GAACCGTCGAAGTTCCAC-3'）、NL1/NL4

（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'/5'-GGT

CCGTGTTTCAAGACGG-3'）对菌株的DNA进行PCR扩增，分别获得GS、ITS、β-TUB2和LSU等4段基因。PCR反应体系（50.0 μL）：上、下游引物各1.0 μL（10 μmol/L），DNA模板5 ng，dNTP 4.0 μL，rTaq DNA聚合酶0.5 μL，10×PCR缓冲液（含Mg2+）5.0 μL、加ddH2O至50.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，共进行30个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后取5.0 μL扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1. 2. 4 PCR产物的克隆与测序 用DNA回收试剂盒回收PCR产物，纯化后的DNA片段经pMDl8-T连接后转化到DH5a感受态细胞中，经蓝白斑鉴定筛选出阳性转化子，阳性转化子送至上海华大基因科技有限公司进行碱基序列测定。将所得基因各序列上传至GenBank中获得20个登录号，登录号见表1。

1. 2. 5 多基因系统发育分析 将供试菌株各基因按GS-β-TUB2-ITS-LSU的连接顺序首尾相连。从GenBank中下载模式炭疽菌的相应基因序列作为参考序列（表1），以相同的连接方式首尾相连。将下载的序列组合与供试茶树炭疽菌各基因的序列组合一起采用MEGA 6.0邻近法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发育进化树，以自展法进行检测，循环1000次，构建供试菌株的系统发育进化树。

2 结果与分析

2. 1 供试菌株的致病性测定结果

致病性测定结果显示，刺破茶树叶片表皮分别接种FFB、FJG、FRG、FSX和FFA等5株供试菌后各处理均能表现病症，各处理病症相似（图1），并能从病斑处组织重新分离获得与原接种菌一致的菌株，新分离菌株所产生分生孢子与原接种菌的形态、大小一致，说明供试菌为茶树炭疽病的病原菌；有伤口接无菌水（CK）和无伤口接种孢子悬液处理均未表现病症，取接种病原菌处茶树叶片组织也未能分离到病原菌，说明供试菌只能从伤口处侵染茶树叶片。

2. 2 茶树炭疽病菌形态学特征

供试5株菌株侵染茶树在叶片上形成灰色病斑，病斑处凹陷，后期易破碎，病健交界处明显（图2-A）。病斑上的小黑点即为分生孢子盘，寄生于叶片表皮下，后期分生孢子穿破表皮，随风雨飞散，作为病原物再次侵染茶树。供试菌株在PSA培养基上纯培养特征相似，在26 ℃黑暗条件下培养时，菌落生长速度为1.34～1.57 cm/d，菌落白色至浅灰色，气生菌丝较长，毯状，边缘较整齐，背面一般会形成黑色物质，培养过程中未见刚毛和菌核，培养后期于菌落中心产生橙黄色分生孢子堆（图2-B、2-C和2-D）。分生孢子椭圆形（图2-E），两端钝圆，浅灰色，表面粗糙，中间凹陷，大小7.5～25.0 μm×2.0～5.5 μm，其中FRG的分生孢子宽度较大，FJG宽度最小。分生孢子上易产生分生孢子附着孢（图2-F），附着孢不规则形、球形，表面黑色或灰黑色，表面灰色颗粒状物明显，大小6.3～10.5 μm×4.5～7.5 μm。参考已发表的文献（Guo et al.，2014）发现供试菌株的形态学特征与C. siamense相似。

2. 3 茶树炭疽菌的分子鉴定结果

多基因系统发育分析结果显示，5株供试炭疽菌与C. siamense聚在一起（图3），结合其形态学特征将5株菌鉴定为C. siamense。通过DNAMAN 6.0多基因序列比对，结果显示4个基因的拼接序列一致性为97.24%，其中各菌株LSU基因序列同源性为100.00%，说明各菌株间的LSU基因最保守；ITS基因序列同源性为99.93%，FFA与其他4株菌株相比在259和397 bp位上存在基因突变；β-TUB2基因序列同源性为99.80%，FFB在第260、267和347 bp上存在基因突变，FFA在460 bp上存在基因突变，FJG在290 bp上存在基因突变；GS基因序列同源性为94.55%，各菌株间存在较多变异，主要出现在基因的中段位置，将各供试菌株GS基因比较发现，FFB与其余4株菌株间的差异相对较明显。

3 讨论

本研究测定了供试5株病原菌菌株的GS、β-TUB2、ITS和LSU基因序列，并进行基于多基因序列的各菌株系统发育分析。从各菌株基因序列的分析结果看，各菌株间存在一定的碱基差异，各菌株GS基因存在的多样性最多， LSU基因不存在基因碱基差异，各菌株ITS和β-TUB2基因间存在2～3个碱基变异，可能是菌株与不同品种茶树寄主之间长期相互作用引起，具体原因有待进一步验证。

C. siamense最早由Prihastuti等于2009年在泰国咖啡树上发现并命名。本研究于2015年在福建农林大学教学和试验茶园中的感染炭疽病的福鼎大白茶、福安大白茶、金观音、水仙和肉桂等品种茶树上采集病叶并分离病原菌株，得到5株分離菌，采用形态学与分子生物学相结合的方法将5株病原菌鉴定为C. siamense。王玉春等（2015）和Liu等（2015）在广东广州、福建泉州、江西南昌、云南普洱等地铁观音、福鼎大白茶和金萱等品种茶树上发现该种炭疽菌侵染茶树；Cheng等（2013）、韩永超等（2014）、李河等（2015）报道该菌还侵染柑橘、草莓和油茶。说明C. siamense既没有寄主特异性，也没有地理专化性。近年来，茶树炭疽病病原菌的分类鉴定取得了一些研究成果，分子生物学技术引用到茶树炭疽病鉴定中后，除文中的C. siamense外，发现能侵染茶树的炭疽菌还有C. gloeosporioides、C. camelliae、C. fructicola、C. acutatum和C. crassipes，但均未发现上述炭疽菌具有地理分布特异性，其中以C. camelliae分布最广，遍布我国的安徽、湖北、重庆、广东、河南、四川、江苏、湖南、贵州、浙江、陕西和福建等12个产茶省（市）（陈宗懋和陈雪芬，1990；Guo et al.，2014；刘威等，2014，2015；Chen et al.，2016）。

本课题组还对从福建省安溪、武夷山、周宁和永春等县（市）茶区部分茶园中分离的茶树炭疽病菌进行鉴定，但仅在福建农林大学茶园茶树上发现C. siamense，在其余产茶县（市）茶树上均未发现该病原菌，可能与采集的样本数量少有关。从病原菌的致病性测定结果来看，C. siamense的致病力相对较弱，属于弱致病菌，但当茶园管理不善或茶树衰老、茶树抗逆性降低时，该菌也能表现出很强的危害性。供试的FFA、FFB和FJG等3株菌株采集于土层仅有20 cm茶园的茶树上，茶树长势相对较差，菌株FSX采集于用于路边绿化的茶树上，缺乏管理，茶树长势不良，可能是在上述茶树上分离到该种炭疽菌的一个原因。另外，本研究致病性测定结果显示，C. siamense是通过伤口侵染茶树叶片，因此在进行茶园耕作时应尽量减少茶树机械损伤，以减少该病菌侵染茶树引发炭疽病。

4 结论

本研究从感染炭疽病的茶树叶片上分离、鉴定出一种弱致病菌——C. siamense，该菌只能通过伤口侵染茶树。生产中应尽量避免人为活动造成茶树叶片损伤，以减少发生茶树炭疽病。

参考文献：

陈宗懋， 陈雪芬. 1990. 茶树病害的诊断和防治[M]. 上海： 上海科学技术出版社： 25-32.

Chen Z M， Chen X F. 1990. Diagnosis and Treatment of Tea Tree Diseases[M]. Shanghai： Shanghai Scientific and Tech-

nical Publishers： 25-32.

韩永超， 向发云， 曾祥国， 张鹏， 顾玉成. 2014. 草莓根颈腐烂病的病原鉴定[J]. 中国农业科学， 47（1）：53-60.

Han Y C， Xiang F Y， Zeng X G， Zhang P， Gu Y C. 2014. Identification of pathogen causing crown and root rot on strawberry[J]. Scientia Agricultura Sinica， 47（1）：53-60.

李河， 周国英， 徐建平. 2015. 一种新油茶炭疽病原Colletotrichum siamense多基因序列鉴定[J]. 植物保护， 41（2）：92-96.

Li H， Zhou G Y， Xu J P. 2015. Pathogen identification of a new anthracnose of Camellia oleifera in China based on multiple-gene sequences[J]. Plant Protection， 41（2）：92-96.

李向阳，吴剑，金林红，陈卓，张瑞杰，张小蓉. 2016. 贵州主要产茶区有害生物的种群调查[J]. 贵州农业科学，44（3）：73-75.

Li X Y，Wu J，Jin L H，Chen Z，Zhang R J，Zhang X R. 2016.Pest population survey of the main tea garden in Guizhou[J]. Guizhou Agricultural Sciences，44（3）：73-75.

刘威， 叶乃兴， 陈玉森， 连玲丽， 刘伟， 金珊， 赖建东， 谢运海. 2014. 茶树炭疽菌Colletotrichum fructicola的鉴定及系统发育分析[J]. 茶叶科学， 34（1）：95-104.

Liu W， Ye N X， Chen Y S， Lian L L， Liu W， Jin S， Lai J D， Xie Y H. 2014. Identification and phylogenetic analysis of anthracnose pathogen Colletotrichum fructicola isolated from Camellia sinensis[J]. Journal of Tea Science， 34（1）：95-104.

刘威， 叶乃兴， 刘伟， 金珊， 连玲丽， 赖建东， 谢运海. 2015. 茶树炭疽菌的鉴定及致病力分析[J]. 福建农林大学学报（自然科学版）， 44（6）：581-586.

Liu W， Ye N X， Liu W， Jin S， Lian L L， Lai J D， Xie Y H. 2015. Identification and pathogenic analysis of the pathogen causing tea plant（Camellia sinensis） anthracnose[J]. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University（Natural Science Edition）， 44（6）：581-586.

陸家云. 1997. 植物病原真菌学[M]. 北京： 中国农业出版社： 186-187.

Lu J Y. 1997. Plant Pathogenic Mycology[M]. Beijing： China Agriculture Press：186-187.

谭济才. 2011. 茶树病虫防治学[M]. 第2版. 北京：中国农业出版社： 179-180.

Tan J C. 2011. Disease and Insect Pests of Tea Plant[M]. The 2nd Edition. Beijing： China Agriculture Press： 179-180.

宛晓春. 2014. 茶叶生物化学[M]. 第3版. 北京：中国农业出版社： 319-349.

Wan X C. 2014. Tea Biochemistry[M]. The 3rd Edition. Beijing： China Agriculture Press：319-349.

王玉春， 郝心愿， 黄玉婷， 岳川， 王博， 曹红利， 王璐， 王新超， 杨亚军， 肖斌. 2015. 中国主要茶区茶树炭疽菌系统发育学[J]. 中国农业科学， 48（24）： 4924-4935.

Wang Y C， Hao X Y， Huang Y T， Yue C， Wang B， Cao H L， Wang L， Wang X C， Yang Y J， Xiao B. 2015. Phylogenetic study of Colletotrichum species associated with Camellia sinensis from the major tea areas in China[J]. Scientia Agricultura Sinica， 48（24）： 4924-4935.

徐欢歡，刘提提，王素敏，黄业伟，刘华戎，王宣军，盛军. 2016. 不同茶类的起泡性和乳化力比较研究[J]. 西南农业学报，29（10）：2351-2355.

Xu H H，Liu T T，Wang S M，Huang Y W，Liu H R，Wang X J，Sheng J. 2016. Comparative studies on foamability and emulsibility of different kinds of tea[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，29（10）：2351-2355.

Chen J， Xu L L， Liu B， Liu X Z. 2007. Taxonomy of Dactylella complex and Vermispora. I. generic concepts based on morphology and ITS sequences data[J]. Fungal Diversity， 26（1）： 73-83.

Chen Y J， Tong H R， Wei X， Yuan L Y. 2016. First report of brown blight disease on Camellia sinensis caused by Colletotrichum acutatum in China[J]. Plant Disease， 100（1）：227-227.

Cheng B P， Huang Y H， Song X B， Peng A T， Ling J F， Chen X. 2013. First report of Colletotrichum siamense cau-

sing leaf drop and fruit spot of Citrus reticulate Blanco cv. shiyue ju in China[J]. Plant Disease， 97（11）：1508-1508.

Guo M， Pan Y M， Dai Y L， Gao Z M. 2014. First report of brown blight disease caused by Colletotrichum gloeosporioides on Camellia sinensis in Anhui province， China[J]. Plant Disease， 98（2）： 284-284.

Hyde K D， Cai L， McKenzie E H C， Yang Y L， Zhang J Z，Prihastuti H. 2009. Colletotrichum： A catalogue of confusion[J]. Fungal Diversity， 39： 1-17.

Liu F， Weir B S， Damm U， Crous P W， Wang Y， Liu B， Wang M， Zhang M， Cai L. 2015. Unravelling Colletotrichum species associated with Camellia： Employing ApMat and GS loci to resolve species in the C. gloeosporioides complex[J]. Persoonia， 35（1）：63-86.

Lubbe C M，Denman S，Cannon P F，Groenewald J Z，Lamprecht S C，Crous P W. 2004. Characterization of Colletotrichum gloeosporioides and similar species associated with anthracnose and dieback of Proteaceae[J]. Mycologia， 96（6）：1268-1279.

Phoulivong S， Cai L， Parinn N， Chen H， Abd-Elsalam K A， Chukeatirote E， Hyde K D. 2010. A new species of Colletotrichum from Cordyline fruticosa and Eugenia javanica causing anthracnose disease[J]. Mycotaxon， 114：247-257.

Prihastuti H， Cai L， Chen H， McKenzie E H C， Hyde K D. 2009. Characterisation of Colletotrichum species associated with coffee berries in northern Thailand[J]. Fungal Diversity， 39（2）：89-109.

Weir B S， Johnston P R， Damm U. 2012. The Colletotrichum gloeosporioides species complex[J]. Studies in Mycology， 73（1）： 115-180.

Yang Y L， Cai L， Yu Z N， Liu Z Y， Hyde K D. 2011. Colletotrichum species on Orchidaceae in southwest China[J]. Cryptogamie Mycologie， 32（3）：229-253.

（责任编辑 麻小燕）