盐碱土锈腐病拮抗菌的筛选和鉴定

丁婷婷　杨泽斌　董广蕊　刘勇　贺香草　张鸿雁

摘要[目的]对黑龙江省大庆地区盐碱土壤进行嗜（耐）盐碱菌的筛选。[方法] 采用不同NaCl浓度梯度的Sehgal-Gibbons平板筛选，利用琼脂块法获得对人参锈腐病病原菌有拮抗作用的嗜（耐）盐碱菌株，并将传统的形态学观察与现代分子生物学技术相结合对其进行鉴定。[结果]从大庆地区盐碱土壤中共分离出48株细菌，其中60.4%的菌株为耐盐菌，其余为中度嗜盐菌。所有菌株的耐碱能力在pH 8.0～11.0，其中64.6%的菌株耐碱能力高达pH 11.0，除2株为嗜碱菌，其余均为耐碱菌。人参锈腐病毁灭柱孢菌R2拮抗性筛选获得3株菌，经形态学、生理生化特征及16SrRNA基因序列的系统发育分析，确定3株菌分别为Halomonas elongata、Halomonas xianhensis和Oceanobacillus iheyensis。[结论]从盐碱土中获得3株对人参锈腐病有拮抗作用的嗜（耐）盐碱菌，并进行了鉴定。

关键词盐碱土；拮抗菌；锈腐病；筛选；鉴定

中图分类号S154.3文献标识码A文章编号0517-6611（2017）33-0142-04

Screening and Identification of Antagonistic Bacteria for Rust Rot from Salinealkali Soil

DING Tingting， YANG Zebin， DONG Guangrui，ZHANG Hongyan* et al

（College of Life Science and Technology， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing， Heilongjiang 163319）

Abstract[Objective] Haloalkaliphilic bacterial strains were screened from salinealkali soil in Daqing City， Heilongjiang Province. [Method]Strains were screened with plate dilution method on different NaCl concentration gradient SehgalGibbons medium. The haloalkaliphilic bacteria with antagonistic activity against rust rot was obtained by plate confrontation method and identified based on morphological observation and modern molecular biology techniques. [Result] 48 strains of bacteria were isolated from salinealkali soil in Daqing City， 60.4% of the strains were grouped into the halotolerant bacteria， and the rest into the moderate halophiles. Alkaline resistance of the strains was between pH 8.0 and 11.0， 64.6% of which pH tolerance reached to pH 11.0. The rest was alkaliresistant bacteria except two basophilic bacteria. 3 strains were obtained by screening antagonistic activity of rust rot C.destructans R2.Morphology，physiological and biochemical characters and phylogeny of 16SrRan gene sequence were analyzed. 3 strains were identified as Halomonas elongate，Halomonas xianhensis and Oceanobacillus iheyensis. [Conclusion] 3 haloalkaliphilic bacterial with antagonistic activity against rust rot were screened and identified from salinealkali soil.

Key wordsSalinealkali soil；Antagonistic bacteria；Rust rot；Screening；Identification

土壤中微生物的生长受到各种环境因素的影响，盐碱土中常含有大量有毒难降解的无机盐，如Ca2+、Mg2+、K+、Na+、Cl-、SO2-4等离子，土壤中微生物长期在此高盐碱条件下进化选择，形成了特殊的细胞结构、生理机能和耐盐机制，并有多种代谢产物可以利用，成为一类潜在的生物资源。近年来嗜（耐）盐碱微生物的研究引起学者们的关注[1-2]。

有学者进行了嗜（耐）盐碱微生物病原菌拮抗性的研究，在河西走廊[3]、新疆荒漠地区[4]、海洋[5]和盐场[6]等都有报道，但针对大慶市盐碱土的研究则很少。大庆市位于黑龙江省西南部、松嫩平原西部，是我国北方土壤盐渍化较严重的区域之一，盐渍化土地面积占东北地区盐渍土总面积的393%[7]。大庆市的土壤类型以小苏打（Na2CO3）和大苏打

（NaHCO3）为主，土壤pH≥8.5，其中会富集多种嗜（耐）盐碱微生物。该文以大庆市盐碱土壤为试验材料，从中获得具有拮抗性的嗜（耐）盐碱性能力强的菌株，为该地区嗜盐、嗜碱菌多样性研究获得更多依据，为嗜盐碱菌在病害生物防治方面的进一步应用提供菌株来源。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1土壤样品。

从大庆市联想科技城（A）、百湖印业（B）、黎明湖（C）、农大北门（D）周边4个样地，选取土壤表面具有碱斑的土壤，利用5点取样法采集5 cm以下表层土壤，装入无菌袋后带回实验室冰箱中保存备用。采样点土壤基本化学性质见表1。

1.1.2供试菌株。

供试病原菌为毁灭柱孢菌R2（Cylindrocarpon destructans R2），从黑龙江省铁力市桃山人参基地病根中分离获得，供试细菌共48株，分离自黑龙江省大庆市盐碱土。

1.1.3培养基。

菌株分离采用Sehgal-Gibbons（简写S-G）培养基[8]，病原菌活化、培养用PDA培养基。

1.2方法

1.2.1盐碱土壤理化性状测定。

将土样烘至恒重，磨细过1 mm 筛用于土壤测定。Ca2+、Mg2+含量测定采用EDTA络合滴定法；K+、Na+含量测定采用火焰光度计法；Cl-含量测定采用AgNO3滴定法；HCO-3、CO2-3含量测定采用双指示剂中和法；SO2-4含量测定采用差减法；pH用pH计 [9]。

1.2.2土壤嗜盐碱细菌分离纯化。

1.2.2.1

菌株富集。将采集带回的土壤样品混匀，称取5 g分别置于含5%NaCl的S-G液体培养基中，于31 ℃160 r/min振荡培养3～5 d。

1.2.2.2

菌株分离纯化。将富集的菌悬液经稀释后涂布于含5%、10%和15%NaCl的S-G培养基平板上，于28 ℃培养5～7 d，根据菌落的生长速度、形状、大小、颜色、边缘、湿度和透明度等表型特征的不同，分别用竹签挑取不同的单菌落，在S-G培养基上以划线法纯化后保存备用。

1.2.3耐盐碱性试验。

1.2.3.1

耐盐性试验。配制不同NaCl浓度的S-G固体培养基，分别为0、3%、5%、10%、15%（W/V），每个梯度重复3次，接种菌株，28 ℃培养3～7 d，观察菌株生长状况。

1.2.3.2

耐碱性试验。将5%NaCl浓度的S-G固体培养基设置6个pH梯度，分别为6.5、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，每个梯度重复3次，接种菌株，28 ℃培养3～7 d，观察菌株生长状况。

1.2.4拮抗菌的筛选。

将制备好的病原菌菌悬液均匀涂布于PDA平板上，用打孔器从培养3～7 d的待筛细菌平皿中打取直径为5 mm的细菌琼脂块，正置PDA平板上，28 ℃培养4～7 d，测定抑菌圈直径及抑菌圈透明度（完全透明，用“+++”表示；出现抑菌圈，但抑制不彻底，抑菌圈内菌丝生长差，用“++”或“+”表示；没有抑菌圈出现，则用“-”表示）。

按公式（1）（2）计算不同抑菌程度的拮抗菌占供试细菌的百分数（S）和占拮抗细菌的百分数（A）。根据拮抗环宽度、透明度，挑选出有价值的拮抗菌用于后续试验。

S=不同抑菌程度拮抗菌株数供试嗜（耐）盐碱菌株数×100%（1）

A=不同抑菌程度拮抗菌株数供试拮抗嗜（耐）盐碱菌株数×100%（2）

1.2.5细菌发酵液对毁灭柱孢菌抑菌活性的测定。

将细菌发酵液去菌体后与PDA 培养基按照 1∶4 的比例混合均匀后倒入培养皿，将病原菌饼（5 mm）接种于培养皿内，菌丝面朝上，28 ℃培养 3 d，用十字交叉法测量菌落直径，得出菌丝生长抑制率，以混合无菌水的 PDA 培养基为对照。

菌丝生长抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%

1.2.6拮抗菌的鉴定。

细菌形态、生理生化特征及总DNA提取参照《常见细菌鉴定手册》[10]。以基因组DNA为模板，采用PCR方法25 μL反应体系扩增16SrDNA，PCR扩增产物测序由上海生工生物工程公司完成。将测序获得的菌株16SrDNA序列提交到NCBI数据库，应用Blast与数据库中的嗜（耐）盐碱菌16SrDNA序列进行相似性比较分析，序列比对及系统发育树分析采用MEGA5.0软件进行。

1.3分析方法

采用Microsoft Excel 2003软件进行数据整理，SPSS 16.0软件对试验数据进行方差分析（LSD法）。

2结果与分析

2.1嗜（耐）盐菌筛选

分别在含不同NaCl浓度的S-G培养基中分离出乳白色、橙黄色、淡黄色等不同颜色的菌落。根据菌落颜色、大小、形状等表型特征初步计数，共获得122株菌，其中5% NaCl培养基的出菌率最高，10% NaCl培养基次之，在15% NaCl培养基中只有极少量的微小菌落出现。

2.2菌株的耐盐碱性试验

根据菌株的生长速度、颜色、形态等表型特征以及耐受盐碱的情况，从122株菌中确定48株典型菌株用于后续试验。

2.2.1菌株的耐盐性。

48株菌中，能耐受3%、5%、10%、15%NaCl的菌株分别为1、8、15和24株。可见NaCl濃度为8%～15%是菌株的主要耐盐浓度。其中19株菌的最适生长NaCl为3%～10%，属于中度嗜盐菌，其余菌株均为耐盐菌（60.4%）。细菌耐盐性结果见表2。

2.2.2菌株的耐碱性。

48株代表菌株的耐碱能力均为pH 8.0～11.0，能耐受pH为8.0、9.0、10.0、11.0的菌株分别有5、7、5、31株。64.6% 的菌株耐碱能力高达pH 11.0。有2株能在pH 9.0～11.0条件下生长良好，且都能在pH<7.0的微酸环境中生长，属于兼性嗜碱菌，其余菌株均属于耐碱菌。细菌嗜（耐）碱性结果见表2。

2.3拮抗性嗜（耐）盐碱菌筛选

从48株嗜（耐）盐碱菌细菌中共筛选得到37株对毁灭柱孢菌具有拮抗性的细菌，其中来自A、B、C、D土壤的菌株分别为11、11、7、8株，分别占该土壤分离全部嗜（耐）盐碱菌的77.8%、73.3%、87.5%、66.7%，占全部48株分离菌的22.9%、22.9%、14.6%、167%。嗜（耐）盐碱菌对毁灭柱孢菌R2的拮抗性结果见表3、4。

由表3、4可知，在37株拮抗菌中，对病原菌R2的抑菌圈≥15.0 mm分别为3、2、2和1株，占全部拮抗菌的81%、54%、5.4%和2.7%，A地分离到的最多，拮抗菌拮抗性中等的在B地最多，没有拮抗性的也是B地最多。

从表3、4还可看出，有8株拮抗菌拮抗作用较强，分别来源于A、B、C、D 4个采样点。5-a5、10-a1和10-a6来源于A采样点，5-b0和5-b7来源于B采样点，10-c6和10-c8来源于C采样点，D采样点只有1株10-d1。8株拮抗菌对病原菌的抑制作用皆很强，且拮抗环完全透明。

安徽农业科学2017年

2.48株细菌无菌发酵滤液对毁灭柱孢菌的抑制作用

拮抗菌筛选获得的8株嗜（耐）盐碱生防菌无菌发酵滤液对毁灭柱孢菌R2的抑菌活性测定结果见表5。由表5可知，8株菌对R2生长都有抑制作用，即均能产生抗菌物质，抑制R2生长。8株菌168 h抑菌率為19.5%～85.4%，在144 h时，10-d1的抑菌率为85.4%。其中来源于A土壤的10-a6、来源B土壤的5-b7和来源于D土壤的10-d1抑菌效果突出，其他5株菌，最高抑菌率为60.2%（5-b0），最低为354%（10-c6）。

2.5拮抗性嗜（耐）盐碱菌鉴定

2.5.1形态和生理生化特征。

10-a6为革兰氏阳性菌，棒状，有鞭毛能运动，菌落圆形，乳白色，光滑；5-b7为革兰氏阴性、需氧菌，短棒状，不运动；菌落黄色；10-d1为革兰氏阳性菌，杆状，有鞭毛能运动，菌落白色或奶酪色，光滑。3株菌生理生化特征见表6。

2.5.2分子生物学鉴定。

将3株嗜（耐）盐菌的序列与NCBI数据库进行Blast比对，利用MEGA5.0软件构建系统发育树（图1）。结果显示，菌株10-d1与Halomonas elongata位于系统进化树上同一分支，其序列的同源性较高，表明它们的亲缘关系较近。结合形态特征、培养特征及生理生化特性，鉴定10-d1为Halomonas elongata，10-a6和5-b7分别与Oceanobacillus iheyensis和Halomonas xianhensis的16SrRNA相近，因此将2菌株5-b7和10-a6初步鉴定为Oceanobacillus iheyensis和Halomonas xianhensis。

3结论与讨论

目前，国内外对高盐碱环境中嗜（耐）盐、碱菌的研究越来越广泛。倪志华等[6]从广东省湛江市徐闻盐场沉积物中分离得到1株中度嗜盐菌N522，该菌株产抗菌活性物质，对温度有较强的耐受性。阎松等[11]采用稻瘟霉法和卤虫法获得盐单胞菌属菌株17B，该菌株可能具有抗菌、抗原虫、抗肿瘤等活性的生物活性物质。国内外研究者对于人参锈腐病的生物防治研究有了一定的进展。陈书华等[12]从木霉菌来源及筛选方法上进行新的尝试，通过离体对峙拮抗筛选试验，将筛选获得的木霉菌处理人参苗床。Kim[13]报道了在韩国应用木霉菌防治人参土传病害的情况，孙卓等[14]证实了菌株SZ-22较已报道生防细菌Bacillus subtilis抑菌谱宽，具有更为深远的生防价值[15]。该试验从大庆市盐碱土中分离到48株嗜（耐）盐碱菌，从中获得3株（10-d1、5-B7、10-a6）对人参锈腐病病原菌毁灭柱孢菌R2具有较好防效的嗜（耐）盐碱菌株，并对其进行了鉴定，确定3株菌分别为Halomonas elongata、Halomonas xianhensis和Oceanobacillus iheyensis。

人参药用价值较高，根部是其药用部位，生物防治意义重大。可将获得的3株菌应用到人参锈腐病的后续试验中，为大庆地区盐碱土中嗜盐碱菌在植物病害生物防治和人参锈腐病生物防治方面的进一步应用提供菌株来源。

参考文献

[1] LEI Z C，QIU P，YE R Y，et al.Bacillus shacheensis sp.nov.，a moderately halophilic bacterium isolated from a salinealkalisoil[J].The journal of general and applied microbiology，2014，60（3）：101-105.

[2] ZHAO B S，WANG H，MAO X W，et al.Halomonas xianhensis sp.nov.，a moderately halophilic bacterium isolated from a saline soil contaminated with crude oil[J].International journal of systematic and evolutionary microbiology，2012，62（1）：173-178.

[3] 王蓓，牛世全，达文燕，等.河西走廊盐碱土壤中抗立枯丝核菌的放线菌筛选[J].生物技术通报，2014（1）：156-160.

[4] 马玥，来航线，韦小敏，等.新疆荒漠盐碱环境中抗动物病原菌的放线菌筛选与鉴定[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2013，41（3）：133-140.

[5] 陈雷，王光玉，卜同，等.一株中度嗜盐細菌 whb45 的鉴定及其抗菌与抗肿瘤活性筛选[J].微生物学通报，2010，37（1）：85-90.

[6] 倪志华，张玉明，周艳芬.一株中性嗜盐菌Halobacillus dabanensis N522的分离鉴定及其抗菌活性研究[J].生物技术通报，2016，32（5）：158-164.

[7] 贾立平，顾云杰，姚和雨.大庆地区盐碱土改良利用初探[J].北方园艺，2000（2）：47-48.

[8] 王钱福.嗜盐菌的分离及其多相分类学研究[D].兰州：兰州大学，2007.

[9] 鲍士旦.土壤农化分析[M].3版.北京：中国农业出版社，1999.

[10] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[11] 阎松，张翼，王珊珊.抗生活性中度嗜盐菌的筛选及菌种鉴定[J].大连交通大学学报，2015，36（S1）：115-118.

[12] 陈书华，李梅，蒋细良，等.防治人参锈腐病木霉菌的筛选及防治效果[J].中国生物防治学报，2016，32（2）：265-269.

[13] KIM S L，SHIM J O，SHIN H S，et al.Suppressive mechanism of soilborne disease development and its practical application.Isolation and identification of species of Trichoderma antagonistic to soil diseases and its activities in the rhizosphere[J].Korean J Mycology，1992，20（4）：334.

[14] 孙卓，杨利民.人参锈腐病生防细菌的筛选及鉴定[J].中国生物防治学报，2015，31（4）：536-542.

[15] MATAR S M，ELKAZZAZ S A，WAGIH E E，et al.Antagonistic and inhibitory effect of Bacillus subtilis against certain plant pathogenic fungi[J].Biotechnology，2009，8（1）：53-61.