基于灰色关联的苗药红禾麻总黄酮含量影响因子分析

邹淑涵 陈胤睿 徐文芬 黄仕清 赵丽婷 齐维娜

摘 要：采用AlCl3比色法对苗药红禾麻42个居群中的总黄酮含量进行分析测定，并用土壤养分测定仪测定对应产地土壤中的铵态氮、速效磷、有效钾、pH值和水分，通过向距产地较近的气象部门查询和以全球卫星定位系统GPS、海拔表等测定地理气候因子，结合42个居群红禾麻ISSR遗传多样性分析结果，运用灰色关联度分析法对红禾麻不同种质资源药材中总黄酮的含量与各影响因子进行相关性分析。结果表明：42个红禾麻不同种质资源药材总黄酮含量为0.42%～2.16%，平均加样回收率为97.86%，RSD为1.5%；环境因子和遗传因子中与总黄酮含量关联度较大的因素分别为无霜期和Shannon信息指数I，而各影响因子与总黄酮含量的关联度中，以Shannon信息指数I（r = 1.03）最大，土壤pH（r = 0.49）最小，表明遗传因子对红禾麻药材总黄酮含量的影响大于环境因子。该研究结果为红禾麻药材优良种质资源筛选及野生变家种研究提供了依据。

关键词：红禾麻种质资源， 总黄酮， 遗传因子， 环境因子， 灰色关联度分析

中图分类号：Q945

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2017）04-0461-10

Abstract：The total flavonoids content of 42 groups of Guizhou miao medicine Laportea bulbifera were analyzed and determinated by AlCl3 colorimetric. The ammonium nitrogen， available phosphorus， available potassium， pH and water were determinated in the soil by soil nutrients tester and the origin of geographical climatic factors of L. bulbifera from different producing areas were consulted. In order to analyze the total flavonoids contents of different germplasm resources and impact factors by grey correlation degree analysis， geographical climate factors were determinated by the closed meteorogical department who had been inquired data and GPS， combined with the ISSR results of genetic diversity of 42 groups with the above measured data. The result revealed that the flavonoid contents of L. bulbifera in 42 groups of different germplasm resources was at 0.42%-2.16%， the average recovery rate was 97.86% and RSD was 1.5%， respectively. Frostfree period and the Shannon information index I were the biggest factors with the flavonoid contents in the environment factors and genetic factors. And the biggest correlation degree was Shannon information index I（r=1.03） and the smallest was the soil pH（r=0.49） in all of correlation degrees. It could be judged that genetic factor had more influence on the quality of medicinal materials L. bulbifera than environmental factor. The results provide the reference for choosing good germplasm resources and change the wild to the domestic.

Key words：Laportea bulbifera germplasm resources， total flavonoids， genetic factors，environmental factors， grey correlation degree analysis

紅禾麻系荨麻科（Urticaceae）艾麻属（Laportea）植物珠芽艾麻 （L. bulbifera）的新鲜或干燥全草，又名红合麻（国家中医药管理局，2005）。红禾麻为贵州重要的苗族药物，收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》中（贵州省药品监督管理局，2003），苗药名为Uabdetdend 蛙斗等，性味辛、温，有小毒，归肝、脾、胃经，具有祛风除湿，活血化瘀之功效，用于治疗风湿麻木，跌扑损伤，骨折等疾病（罗迎春和孙庆文，2013）。该药材为贵州同济堂有限公司民族药“润燥止痒胶囊”的主要原料药材，对治疗老年血虚引起的皮肤瘙痒有独特疗效，市场竞争力较强。一直以来，红禾麻的原材料供给主要依靠采挖野生资源，随着市场需求量逐年增加，野生资源逐年锐减，药材质量良莠不齐，已不能满足生产需要，目前亟需筛选优良红禾麻种质资源进行野生驯化研究。

种质资源是提高中药材质量的关键和源头，种质的优劣对中药材的产量和质量有决定性的作用，是进行中药材规范化基地建设的先决条件。红禾麻种质资源药材质量是由不同生境中的某种环境因子造成，还是不同居群的遗传背景不同造成？它们与环境因子或遗传背景之间是否存在某些关联？这对筛选红禾麻优良种源非常重要。通过查阅国内外相关文献对红禾麻的研究报道，红禾麻主要含有黄酮类和香豆素类化合物，黄酮类具有较强抗氧化活性（Mincheol et al，2003），香豆素类具有较好的镇痛抗炎和免疫抑制作用（向明等，2006，2009；苏志强等，2009；侯文睿等，2010；马琳等，2012）。因此，本文采用比色法，以总黄酮为测定指标，建立含量测定方法，分析测定红禾麻不同种质资源药材中总黄酮含量，并与对应种源ISSR遗传多样性分析结果（内因）和环境因素（外因），通过灰色关联度分析红禾麻不同种质资源药材总黄酮含量与各影响因子的关联度，探讨内因和外因对红禾麻药材总黄酮含量的影响，为红禾麻药材优良种质资源筛选及相关产业的可持续发展提供前期研究基础。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

UV1800紫外—可见分光光度计（日本岛津公司）；TPY-6型土壤测试仪（浙江托普仪器仪有限公司）；etrex venture手持GPS基准定位仪（中国台湾）等。芦丁对照品（购于中国食品药品检定研究院，批号100080-200707，供UV测定的含量为92.5%），三氯化铝、甲醇、乙醇等其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

所有供试样品均为课题组于各分布点采集，经贵阳中医学院孙庆文教授鉴定为荨麻科艾麻属植物珠芽艾麻（L. bulbifera）的地上部分，凭证标本存放于贵阳中医学院生药实验室。同时以深度约20 cm、对角线布点采集相应产地土壤。药材置于40 ℃鼓风干燥，粉碎过3号筛，置干燥器中备测。土壤样品自然风干，粉碎过2号筛，置干燥器中。药材样品信息详见表1，土壤样品信息详见表2。

1.2 红禾麻不同种质资源药材中总黄酮含量测定方法的建立

1.2.1 对照品溶液及显色剂制备 精密称取芦丁对照品30.80 mg，置于100 mL的容量瓶中，加70%乙醇溶解制成0.284 9 mg·mL-1芦丁对照品溶液。称取AlCl3 25 g，加水溶解，制成10% AlCl3溶液，备用。

1.2.2 供试品溶液的制备 取样品粉末约1 g，精密称定，置于100 mL锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定重量， 置于水浴中加热回流1 h， 放冷至室温，再称定重量，用70%乙醇补足减失重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液10 mL，分别等量加入石油醚（30～60 ℃）萃取4～5次，至石油醚层无明显变化后，取下层萃取液，即得供试品溶液，精密量取该溶液0.5 mL，按照标准曲线的绘制方法，自“加入10%AlCl3”起，依法测定其吸光度值。

1.2.3 标准曲线绘制 分别精密吸取“1.2.1”下芦丁对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL的容量瓶中，各加入10% AlCl3溶液2 mL，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得一系列浓度的芦丁对照品溶液，于40 ℃水浴中显色反应30 min，取出，摇匀，以相应试剂为空白，于406 nm波长处分别测定其吸光度，以芦丁对照品溶液的浓度为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标，計算其回归方程。

1.2.4 样品测定 分别称取42个不同种质资源红禾麻药材样品粉末约1 g，精密称定，分别按“1.2.2”项下的方法制备供试品溶液，依照标准曲线项下方法，自“加入10%AlCl3”起，依法测定其吸光度值，将测得的吸光度值代入上述回归方程，分别计算其以芦丁计总黄酮的含量。

1.3 红禾麻不同种质资源产地的环境因子采集及测定

1.3.1 地理气候因子的采集及查询 采用手持GPS基准定位仪，测定红禾麻不同种质资源产地的海拔、经度及纬度，并通过当地气象部门查询气象资料，获取年平均温度、7月平均温度、年均降水量、年均日照时数以及无霜期等数据。

1.3.2 土壤养分测定 采用土壤养分速测仪，测定42个居群红禾麻产地土壤样品中铵态氮、速效磷、有效钾的含量以pH值；依照《中国药典》2015年版四部0832水分测定第二法（ 烘干法）测定其水分含量（国家药典委员会，2015）。

1.4 红禾麻不同种质资源遗传多样性测定分析

1.4.1 总DNA的提取及ISSR引物的合成与筛选 采用CTAB法提取红禾麻总DNA，以1.0%琼脂糖凝胶电泳法检验DNA质量，核酸定量分析仪检测DNA纯度， -20 ℃保存备用。ISSR引物设计参照加拿大哥伦比亚大学公布的序列（No.801-900），由上海生工生物工程股份有限公司合成。从70条ISSR引物中筛选出10条多态性好，条带分布均匀，清晰易辨的引物来扩增。

1.4.2 PCR扩增与产物检测及数据分析 反应体系为25 μL的体系中包含模板DNA 1 μL，2×Taq PCR MasterMix 13 μL，引物（10 μmol·L-1）1 μL，用灭菌超纯水补至25 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；52～58.2 ℃退火45 s；72 ℃延伸1.5 min，40次循环；72 ℃后延伸7 min。PCR产物7 μL于1.5%琼脂糖凝胶中电泳1.0 h左右， 溴化乙锭染色，在凝胶成像系统下观察拍照。同一引物扩增的电泳迁移率一致的条带有带记为“1”，无带记为“0”，形成0/1矩阵。采用Popgene 32软件计算42个居群红禾麻的多态位点、多态性位点百分率（PPL）、Neis遗传多样性指数（H）、Shannons多态性信息指数（I）、遗传分化系数（Gst）和基因流（Nm），分析其遗传多样性水平。

1.5 红禾麻总黄酮含量与影响因子的灰色关联度分析

灰色关联度分析法，是对一个动态变化系统发展态势的量化比较。本研究以42批红禾麻药材中总黄酮含量作为母序列，对应产地的环境因子（外因）及遗传因子（内因）为子序列，先对原始数据进行标准化，根据下述公式计算出红禾麻药材中总黄酮含量与各影响因子的灰色关联系数。其中，分辨系数ρ为0.5。

再根据下述公式计算灰色关联度：

2 结果与分析

2.1 红禾麻种质资源药材中总黄酮含量测定结果

实验结果显示，标准曲线绘制，计算得回归方程和相关系数为A=28.03C+0.028 3，r=0.999 5，表明芦丁对照品溶液浓度在5.698～28.49 μg·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系。其方法学考察结果：精密度，计算相应芦丁对照品溶液吸光度值的RSD值为0.15%，表明仪器的精密度良好；重复性，计算以芦丁计总黄酮含量的RSD值为1.1%，表明本法测定的重复性良好；稳定性，计算相应供试品溶液吸光度值的RSD值为0.19%，表明供试品溶液显色在60 min内基本稳定；加样回收率，计算以芦丁计总黄酮含量的平均回收率为97.86%，RSD值为1.5%，表明该方法测定的准确度较高。42个红禾麻种质资源药材中总黄酮含量为0.42%～2.16%，含量差异较大（表3）。

2.2 红禾麻不同种质资源产地的环境因子采集及测定结果

红禾麻种质资源不同产地地理气候因子数据见表1，土壤样品中铵态氮、速效磷、有效钾、土壤pH值及水分含量结果见表2。

2.3 红禾麻不同种质资源的ISSR遗传多样性分析结果

多态性位点数（PPB）、多态位点百分率（PPL，%）、等位基因数Na、有效等位基因数Ne、Neis基因多样性H、Shannon信息指数I等6个指标均可用于评价遗传多样性水平，它们的值越大，说明遗传多样性水平越高（表4）。

2.4 红禾麻总黄酮含量与环境因子及遗传因子的灰色关联度分析

红禾麻药材中总黄酮含量与各影响因子的灰色关联度结果见表5。表5结果显示，各影响因子对红禾麻药材中总黄酮含量影响为Shannon信息指数I（r=1.03）>经度（r=0.97）>无霜期（r=0.95）>Neis指数H（r=0.91）> 7月均温（r=0.84）>年均气温（r=0.82）>土壤有效钾（r=0.81）>土壤铵态氮（r=0.77）>年均日照数（r=0.75）>土壤水分（r=0.72）>土壤速效磷（r=0.71）>年均降水量（r=0.69）>海拔（r=0.64）>纬度（r=0.63）>土壤pH值（r=0.49），環境因子中无霜期和经度与总黄酮含量关联度较大，其中总黄酮含量较高的产地贵州省赫章县罗布石林（8号居群）、贵州省梵净山蘑菇石（22号居群）、贵州省梵净山拜佛台（24号居群）、贵州省松桃县乌罗镇（29号居群），这四个产地经度较大无霜期较长，研究结果提示可以通过大棚培育调整无霜期天数以增加有效成分积累，可提高红禾麻药材总黄酮含量。而在所以影响因子中Shannon信息指数I和Neis指数H与红禾麻总黄酮含量关联度最大，表明遗传因子是影响红禾麻药材总黄酮含量的主导因子，结果显示Shannon信息指数I和Neis指数H越大，即遗传多样性水平越高的居群，总黄酮平均含量较大，如：居群贵州省赫章县罗布石林（4号居群）、贵州省赫章县罗布石林（8号居群）、贵州省赫章县韭菜坪（9号居群）、贵州省梵净山拜佛台（24号居群）遗传多样性水平较高（Shannon信息指数I （0.302 8～0.441 9），而其总黄酮含量也较高（1.43%～2.16%）。

3 讨论

灰色关联度分析是一种根据因素间发展趋势的相似或相异程度，利用各子因素间的数值关系对一个动态变化的系统进行量化分析的方法。该方法简单易行，克服了回归、相关性等分析方法的局限性。李倩等（2010）运用灰色关联度分析法确定了影响丹参品质的主导气候因子，王宗权等（2010）运用灰色关联度分析法确定了影响黄芪3种皂苷成分的主导环境因子分别为年均气温和平均无霜期， 蔡萍等（2014）运用灰色关联度法分析影响杜仲中4种有效成分含量产地差异的主要环境因子。本研究运用灰色关联度分析法，以红禾麻不同种质资源药材中总黄酮含量作为母因素，以各环境因子和评价遗传多样性水平的指数作为子因素进行分析，通过对苗药红禾麻种质资源42个地理居群的各影响因子与总黄酮含量变化的分析，Shannon信息指数I、Neis指数H、经度、无霜期4个影响因子的关联度较大（>0.90），其中Neis指数H关联度最大，表明各影响因子中内因（遗传因子）对红禾麻药材总黄酮含量影响最大，因此选择遗传变异较小的优良种质资源，能够更好地控制药材品质，其中贵州赫章县罗布石林（4、8号居群），贵州赫章县韭菜坪（9号），贵州梵净山拜佛台（24号居群）4个居群的遗传多样性指数和总黄酮含量较高，不仅可以作为人工育种的选育材料，而且对于苗药红禾麻种植适生地区划研究有很好的参考价值。

本研究所建立的红禾麻药材总黄酮含量测定方法简便快速、准确可行，可作为苗药红禾麻药材的质量控制方法，为《贵州省中药材、民族药材质量标准》（2003年版）收载的红禾麻药材质量标准提升奠定一定的实验基础。

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