木霉菌株挥发性物质拮抗尖孢镰刀菌的效果及其鉴定

张雯雯 国振宇 赵晓迪 龚明波 李世贵 顾金刚 杨礼富

摘 要 采用对扣法研究11株木霉菌株挥发性物质对尖孢镰刀菌的抑制效果，采用固相微萃取和气质联用技术对挥发性物质进行成分分析。结果表明，不同木霉菌株产生的挥发性物质的种类和含量差异较大。11株木霉共检出257种挥发性物质，均能检测到六甲基环三硅氧烷、八甲基环四硅氧烷两种化合物；聚类分析在相关系数距离为19时，可将11株木霉菌株归为三大类；257种挥发性物质可简化为3个主成分，包含30种挥发性物质，不同木霉挥发性物质主成分得分与拮抗尖孢镰刀菌的抑菌率之间极显著相关，表明11株木霉菌株对尖孢镰刀菌均有抑制作用。

关键词 木霉；尖孢镰刀菌；挥发性有机物；抑菌率；主成分分析

中图分类号 S432.4 文献标识码 A

Abstract The inhibitory effects and compounds of volatile substances from 11 Trichoderma strains against Fusarium oxysporum were analyzed. The results showed that there were significant differences between the contents and types of volatile substances of different Trichoderma species. 11 species of Trichoderma were detected 257 kinds of volatile substances， Which can be detected hexamethyl cyclotrisiloxane， octamethyl cyclotetrasiloxane two compounds； When the cluster analysis in the correlation coefficient distance was 19 hours， the 11 Trichoderma could be divided into 3 components. The results showed that ACCC33104 had the highest total score of 30 volatile substances， and the difference of the volatile components of T. viride was different from that of its antagonistic effect on F. oxysporum. The effect of bacteria have a certain relevance. The results showed that Trichoderma had inhibitory effect on F. oxysporum.

Key words Trichoderma； Fusarium oxysporum； volatile organic compounds； antimicrobial rate； principal component analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.04.019

尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、棉、豆科及花卉等多种植物枯萎病的发生，如香蕉枯萎病就是由古巴尖孢镰刀菌引起的一种土传病害[1]。微生物能够产生多种挥发性的次级代谢产物[2]，且具有分子量低、弱极性、低沸点和亲脂性等特点[3-4]，能够长距离传播，并介导有机体间非直接接触的相互作用。木霉菌是一类重要的植物病害生防菌[5]，不同种属的木霉产生的挥发性物质种类和含量不同，且对病原真菌有不同的抗菌活性[6-7]。Klaus Fiedler[8]等测定哈茨木霉和拟康宁木霉的挥发性物质，发现它们能够产生乙醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇和3-辛酮等化合物，并且产生的倍半萜类显示了1个典型的特征图谱；Tarus[9]等测定了哈茨木霉和长枝木霉的挥发性有机物及其对细菌和蜜环菌的抑制作用，结果表明6-戊基-2H-吡喃-2-酮具有最高的抗真菌和抗菌活性，且在200 ppm时完全抑制蜜环菌的生长；Samantha Lee等[10]检测了生长5 d和14 d深绿木霉的挥发性物质，发现随着木霉的生长，有极少的挥发性物质不再能被检测，而产生了更多的新的挥发性物质，这就说明木霉产生的种类与木霉菌株本身的年龄有关。本研究针对香蕉枯萎病研究11株木霉所产生的挥发性物质对其的拮抗效果，同时对不同种属的木霉菌株产生的挥发性有机物进行成分分析，以探索木霉挥发性物质的种类和含量及其对尖孢镰刀菌抑制效果之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

木霉菌株保存在中国农业微生物菌种保藏管理中心和本实验室： Trichoderma atroviride 5-1P1（菌株编号：ACCC32804）、T. atroviride 16-1M2（菌株编号：ACCC32818）、T. atroviride 70-1M3（菌株编号：ACCC32866）、T. harzianum 71-1P2（菌株编号：ACCC32870）、T. atroviride 193-2P1（菌株编号：ACCC33007）、T. atroviride 222-2M1（菌株编号：ACCC33100）、T. harzianum 223-2M1（菌株编号：ACCC33104）、T. harzianum 226-2P1（菌株编号：ACCC33114）、T. atroviride 231-1M2（菌株编号：ACCC33124）、T. atroviride 247-2P2（菌株编号：ACCC33189）、T. atroviride 258-2M1（菌株编号：ACCC33205）。植物病原菌：香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种FOC4（菌株编号：ACCC38875）作为靶标病原菌，由中國农业微生物菌种保藏管理中心提供，用于木霉挥发性物质对其抑制作用的研究。

1.2 方法

1.2.1 木霉挥发性物质对尖孢镰刀菌的作用 采用对扣法[11]。用打孔器（d=0.5 cm）在培养5 d的木霉菌菌落边缘打取菌龄相同的菌块，接种于PDA平板中央，在其上盖双层直径略大于10 cm的无菌玻璃纸，上方扣一个直径同为9 cm，中央刚接种尖孢镰刀菌（d=0.5 cm）的平板，用封口膜密封。以未接种供试木霉的PDA平板与接病原菌的平板对扣培养作为对照，每个处理设3个重复。5 d后用十字交叉法测量病原菌菌落直径，计算抑菌率。

抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-0.5）×100%

1.2.2 木霉挥发性物质的分离 将供试菌株接种在PDA培养基上，25 ℃培养7 d，用打孔器（d=0.5 cm）取1块菌饼接种在二分隔培养皿一侧小室的PDA培养基上，用双层封口膜封住培养皿，25 ℃培养7 d。以不接种木霉的空白PDA平板作为对照。

首先将固相微萃取（SPME）针头插入气相色谱仪的进样口，推出萃取头，在氦气流中240 ℃老化20 min，然后将萃取头缩回保护针管，立即将SPME针头插入二分隔培养皿未培养木霉的一侧小室，推出萃取头，萃取挥发性物质45 min，再将SPME针头插入气相色谱仪的进样口，推出萃取头，解吸附30 s，随后取出SPME进样手柄和萃取头。

1.2.3 木霉挥发性物质的鉴定 色谱条件[12]：用HP-5MS型毛细管柱分离挥发性物质，载气为氮气，流速为1 mL/min，不分流模式。升温程序：30 ℃维持2 min，再以5 ℃/min的速率升温至220 ℃；post run 270 ℃维持1 min。电离电压为70 eV，离子源温度230 ℃，质谱扫描速率为3.35 scans/s，质谱范围20～450 amu。

1.3 数据处理

数据分析与处理采用质谱化学工作站软件分析（MSD ChemStation G1701DA，安捷伦公司），通过Agilent NIST13数据库鉴定挥发性物质，扣除对照组检测到的色谱峰，用峰面积归一化法测定了这些化学成分在各自样品中的相对含量。用SPSS 16.0 软件进行抑菌率的统计分析以及挥发性物质的聚类分析、主成分分析以及相关性分析。

2 结果与分析

2.1 挥发性物质拮抗效果分析

不同种属木霉产生的挥发性物质对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制率不同。其中，菌株ACCC33104、ACCC33100、ACCC33007、ACCC33124、ACCC33205这5株菌的抑菌率分别为35.29%、34.02%、33.19%、30.22%、30.17%；菌株ACCC32866、ACCC32818的抑菌率分别为28.77%、28.23%；菌株ACCC33189、ACCC32870、ACCC32804、ACCC33114的抑菌率则分别为23.61%、22.69%、21.88%、20.83%（见图1）。根据差异显著性分析，菌株ACCC33104、ACCC33100、ACCC33007，菌株ACCC33124、ACCC33205、ACCC32866、ACCC32818，菌株ACCC33189、ACCC32870、ACCC32804、ACCC33114这三组之间差异并不显著，其余均存在显著差异。

2.2 挥发性物质成分分析

通过对GC-MS谱图的NIST 13谱库搜索和人工解析，从11株木霉中共鉴定出257种挥发性物质，结果见表1。其中，烷类68种，酯类47种，烯类36种，醇类29种，酮类23种，苯类9种，醚类7种，其他44种，分别占检出挥发性物质的26.46%、18.29%、14.01%、11.28%、8.95%、3.50%、2.72%和17.12%，就种类的多样性而言，木霉产生的挥发性物质主要是烷类、酯类，其次是烯类、醇类和酮类；就含量的多样性而言，木霉产生的挥发性物质主要是醇类。其中，在11株木霉中均能检测到六甲基環三硅氧烷、八甲基环四硅氧烷两种化合物，其相对含量范围分别为0.540 9%～6.111 5%、0.345 2%～4.430 8%。

2.3 挥发性物质聚类分析

从表1可见，不同种属木霉产生的挥发性物质的种类和含量存在较大差异，甚至同一种属木霉产生的挥发性物质的种类和含量也不同。由图2可见，相关系数距离为19时，可以把11株木霉分成三大类，第一类包括ACCC33124、ACCC33205、ACCC33114、ACCC32870、ACCC33189、ACCC32866、ACCC32818；第二类包括ACCC32804；第三类包括ACCC33007、ACCC33104、ACCC33100；聚类结果表明：每一类别中木霉产生的挥发性物质较为接近。进一步分析表明：木霉产生的挥发性物质种类与木霉种属之间无相关性。

2.4 11株木霉挥发性物质的主成分分析

选取30种物质对11株木霉产生的挥发性物质进行主成分分析，从主成分特征值和贡献率（表2）可见，前3个主成分的贡献率分别为43.396%、15.892%、13.615%，累积贡献率达到72.903%。因此，提取3个主成分，即m=3。从旋转后的因子载荷矩阵表（表3）可知，3个主成分包含的挥发性物质反映了11株木霉挥发性物质的主要信息。

从表3可知，第1主成分主要反映乙醇、2-甲基-1-丙醇、六甲基-环三硅氧烷、八甲基-环四硅氧烷、十甲基-环戊硅氧烷、十二烷、十三烷、十二甲基-环己硅氧烷、十四烷、2，2，3，5，6，6，7-七甲基[1，4，2，3，5，6，7]二氧杂戊烷、3-羟基丁酮、6-戊基-2H-吡喃-2-酮、1，3-二甲基-苯、丁基化羟基甲苯、苯乙烯、反式 - 香柠檬烯、2-戊基-呋喃、二氧化碳、阿莫地喹等成分的信息；第2主成分主要反映亚硫酸，2-乙基己基十六烷基酯、乙苯、[S-（E，Z，E，E）]-3，7，11-三甲基-14-（1-甲基乙基）-1，3，6，10-环十四碳四烯、（E）-3-十二碳烯、2，2，4，6，6-五甲基-3-庚烯等成分的信息；第3主成分主要反映二甲基-硅烷二醇、3-甲基-1-丁醇、三甲基-十二烷、2，6，10，14-四甲基-十六烷、（R*，R*）-（.+/-.）-1，1-[1，2-双（1，1-二甲基乙基）-1，2-乙二基]双-环己烷、β-水芹烯等成分的信息。

第1主成分主要是以烷類为主，第2主成分主要是以烯类为主，第3主成分主要以烷类和醇类为主，这与总成分分析得出的种类多样性结果基本相符，因此这些主成分具有较强的代表性，可以作为评价木霉产生挥发性物质种类的重要指标。

根据各主成分的贡献率可以得到主成分综合评价指数，在本研究中，主成分综合评价指数F=0.60F1+0.22F2+0.19F3。

11株木霉的挥发性物质的3个主成分得分见表4，可见综合排名ACCC33104为第一，其次为ACCC33100和ACCC33007。

2.5 相关性分析

将11株木霉挥发性物质的主成分得分与拮抗尖孢镰刀菌的抑菌率进行相关性分析，结果表明（表5），挥发性物质的主成分得分与抑菌率之间的相关性系数为0.869，对应的显著性为0.001，表明二者之间的相关性达到极显著水平。这就说明ACCC33104菌株在拮抗尖孢镰刀菌和产生挥发性物质上都具有较强的优势。

3 讨论

本文以香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种FOC4为靶标，对木霉菌株所产挥发性物质的抑菌效果以及成分进行分析。研究结果表明，T. atroviride 5-1P1等11株木霉挥发性物质对尖孢镰刀菌均有明显的抑制作用。从11株木霉中共鉴定出257种挥发性物质，其中烷类68种，酯类47种，烯类36种，醇类29种，酮类23种，苯类9种，醚类7种，其他44种，多于现有的研究报道[4，13-14]。木霉挥发性物质与拮抗尖孢镰刀菌的抑菌率显著相关。不同种属的木霉在挥发性物质的种类和含量上存在一定差异，这种差异与木霉本身的性质、营养条件以及萃取方法的不同都有一定的关系[13，15]。Wheatley[16]等测定了拟康宁木霉和绿色木霉在两种不同培养基上的挥发性物质，发现不同的木霉种属和培养基类型能够产生不同种类和含量的挥发性物质，这与本研究得到的结果相符。截至目前，尽管大量的木霉产生的挥发性物质已被鉴定，但仅少数挥发性物质的功能被证实。6-戊基-2H-吡喃-2-酮，具有特征的甜椰子状香味的聚酮化合物，其主要生物学功能包括减少霉菌毒素的产生[17-18]、抗真菌活性[19]以及促进生长等[20]，本研究中能够产生该物质的木霉有6株，含量从0.79%～19.6%，该物质在康宁和哈茨木霉中均有报道，但本研究中有4株深绿木霉中首次被检出。通过深入研究，有望揭示木霉挥发性物质拮抗尖孢镰刀菌的作用机制，为研发由尖孢镰刀菌引起的作物土传病害生物防治技术奠定理论基础。

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