福建水生植物浮萍的形态学和分子系统学鉴定及遗传多样性研究

叶松建 韩冰莹 张家明

摘 要 在福建53个市县（区）收集获得119份浮萍种质。通过叶片大小、根系和叶脉数等形态性状初步鉴定为4个属：少根紫萍属（Landoltia）、多根紫萍属（Spirodela）、无根萍属（Wolffia）、浮萍属（Lemna）。利用叶绿体atpF-atpH间隔序列和rpS16内含子序列进行系统发育分析。结果表明，119份浮萍种质分别属于4个种Landoltia punctata，Spirodela polyrhiza，Wolffia globosa，Lemna aequinoctialis。利用DnaSP 5.10.01軟件分析结果显示，福建浮萍种质存在丰富的遗传多样性，且rpS16比atpF-atpH多样性大，两者的核苷酸多态性指数分别为0.051 23和0.031 53，每kb平均核苷酸差异数为44.675和20.374，群体突变率分别为0.051 64和0.036 40，单倍型多态性指数分别为0.617和0.577。稀脉萍、无根萍和多根紫萍基于atpF-atpH和rpS16序列的单倍型数为4、2、2。另外，闽南地区浮萍遗传多样性高于闽北地区，其核苷酸多态性指数、每kb核苷酸变异数以及群体突变率分别是闽北地区的2倍以上。

关键词 浮萍；形态学；分子系统学；遗传多样性；发育树

中图分类号 Q94 文献标识码 A

Abstract 119 duckweed germplasms were collected in 53 cities or countries in Fujian Province. They were classified into four genera： Landoltia， Spirodela， Wolffia， and Lemna using morphological analysis based on leaf size， root and leaf number. The chloroplast atpF-atpH internal sequence and the rpS16 intron sequence were obtained by PCR amplification and sequencing. Phylogenetic analysis indicated that these germplams belong to four species： Landoltia punctata， Spirodela polyrhiza， Wolffia globosa， and Lemna aequinoctialis. Genetic diversity analysis using DnaSP 5.10.01 software showed that germplasms had rich diversity， and rpS16 presented more diversity than atpF-atpH. The nucleotide diversity of atpF-atpH and rpS16 was 0.031 53 and 0.051 23，respectively； the distinct nucleotide number per kb was 20.374 and 44.675， respectively； the population mutation rate was 0.036 40 and 0.051 64， respectively， and the haplotype diversity was 0.577 and 0.617， respectively. The haplotype numbers of atpF-atpH and rpS16 were 4， 2， and 2， respectively. The genetic diversity in South Fujian was higher than that in North Fujian， and the nucleotide diversity， different nucleotide number and the population mutation rate of atpF-atpH in South Fujian were twice as high as those in the North.

Key words duckweed； morphology； molecular systematics； genetic diversity； phylogenetic tree

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.04.015

浮萍科（Lemnaceae）植物包括5个属：浮萍（绿萍）（Lemna）、少根紫萍（Landoltia）、多根紫萍（Spirodela）、无根萍（Wolffia）、扁平无根萍（Wolfiella），共37个种[1-3]。由于浮萍在自然界中易受环境因素的影响，而使得浮萍的形态发生改变，少数浮萍可通过外形及其他特征鉴定到种，故浮萍形态学的鉴定相对困难。浮萍是一种最小的被子植物，分布极为广泛，它是漂浮在水体表面，如湖泊、稻田、废水池塘、小沟渠等[4]。浮萍具有高含量的蛋白质，可作为水禽类的重要食料[5-8]。不仅是禽类喜吃浮萍，在人类的世界中，也有一些地区以浮萍为菜蔬。浮萍已经被证明具有处理农业废水的功能，它们具有生长速度快，吸收氮、磷等特点[9-10]。近年来，浮萍在生物燃料中的应用前景受到广泛关注。浮萍在特定生长条件下叶片中淀粉含量高，且木质素含量较低[11]，利用浮萍的淀粉发酵生产燃料乙醇，产率高达97.8%[12-14]。目前有关浮萍DNA分子标记技术鉴定物种研究报道较少，故而本研究利用atpF-atpH条形码序列与rpS16内含子序列进行分子标记遗传分析，并对浮萍遗传多样性进行初步性的研究。不同来源、不同种类的浮萍，生物学特性及应用领域差异很大，因此广泛收集浮萍种质资源并进行遗传多样性研究和筛选具有重要价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本研究所用的119份浮萍种质分别收集于福建53个市县（区），采集地点见图1。

1.1.2 无菌株系的制备 将野外采集的浮萍用自来水冲洗3～5遍，用Hoagland全营养液培养数天。每份材料取其中5株，用5%漂白液（蓝月亮）在超净工作台上漂洗2 min，转移至无菌含1%蔗糖的1/2Hoagland营养液中，每瓶营养液1株浮萍，置于24～30 ℃，光照强度为2 000 lx的培养箱中培养。培養一周后，挑选无污染的浮萍大量繁殖培养，并编号保存到浮萍种质资源库。

1.2 方法

1.2.1 形态学鉴定 对无菌培养的浮萍进行形态学鉴定，测量叶状体大小，观察根的数量和叶脉的数量等。如图2所示，A1为浮萍（绿萍），B1为多根紫萍，C1为少根紫萍，D1为无根萍；A2、B2、C2、D2分别为浮萍（绿萍）、多根紫萍、少根紫萍、无根萍的单个克隆的正面形态，用体视显微镜拍照；A3、B3、C3、D3分别为浮萍、多根紫萍和少根紫萍、无根萍的背面；A3的多根紫萍中背面紫色不多，可能是因为光照强度不够或是培养时间较短（蓝色箭头标示叶片叶脉，橘黄箭头标示植株根部及根长，红色箭头标示呈现紫色的部位）。

1.2.2 DNA提取、PCR扩增及测序 以无菌浮萍为材料，使用DNA提取试剂盒（TIAN GEN新型植物基因组DNA提取试剂盒DP320-02）提取浮萍总DNA（按试剂盒说明书步骤进行）。叶绿体atpF-atpH间隔序列用引物HNP307（5' ACTCGCACACACTCC CTTTCC 3'）和HNP308（5' GCTTTTATGGAAGCTTA AACAAT 3'）扩增。叶绿体rpS16内含子序列用引物rpS16F（5' GGTTTAGACATTACTTCGGTG 3'）和rpS16R（5' TAATGTCTAAACCCAAGGA 3'）扩增。反应体系为：1 μL的DNA模板、1 μL的引物、4 μL的10× dNTP Mix、5 μL的10× La PCR buffer、0.5 μL的LaDNA聚合酶，37.5 μL的去离子水。PCR扩增反应程序为：94 ℃预热变性4 min；94 ℃变性30s，50 ℃降温30 s，72 ℃延伸1 min，34个循环；72 ℃延伸7 min后，将扩增产物进行凝胶电泳检测。扩增产物由华大基因公司测序。

1.2.3 分子系统学及遗传多样性分析 DNA序列测序结果用MacVector15组装成完整序列。通过NCBI数据库BLAST分析，筛选出可靠的37个浮萍科物种的代表性序列，与福建浮萍序列一起，进行分子系统学分析。先用MacVector进行序列比对，然后用Mega6.0软件构建系统发育树，确定浮萍分类地位。将福建浮萍序列比对结果输入DnaSP5.10.01软件，分析福建不同地区浮萍种的遗传多样性，其中包括单倍型数、单倍型多态性指数（Hd）、核苷酸多态性指数（Pi）、群体突变率（沃特森估计量θw）和平均每kb核苷酸差异数。

2 结果与分析

2.1 通过形态学性状对福建浮萍种质进行分类鉴定

用肉眼或者显微镜观察浮萍种质的叶状体大小、颜色、叶片成簇数、叶脉数、根数等形态学性状，对浮萍种质进行分类，结果表明福建119个浮萍种质分别属于4个属：少根紫萍属（Landoltia）、多根紫萍属（Spirodela）、无根萍属（Wolffia）、浮萍属（Lemna）（表1）。浮萍属（Lemna species）数量最多，有91份；多根紫萍属（Spirodela）次之，有15份；少根紫萍属（Landoltia）只有7份种质；无根萍属（Wolffia）最少，有6份种质。

2.2 atpF-atpH和rpS16 DNA片段的扩增

图3是部分浮萍株系的叶绿体atpF-atpH间隔序列和rpS16内含子序列PCR扩增结果。所有119份种质都扩增到了atpF-atpH和rpS16的DNA片段，其中atpF-atpH片段长度约为650 bp，rpS16片段长度约为1 000 bp。

2.3 分子系统发育分析

利用叶绿体atpF-atpH间隔序列与rpS16内含子序列进行分子聚类分析，结果表明，119份浮萍种质聚类到4个种（图4），分别是Lemna aequinoctialis，Spirodela polyrhiza，Landoltia punctata，Wolffia globosa。用两种序列所得出的结果完全吻合，并且与形态学分类结果（图2）一致。其中，Lemna aequinoctialis种质数量最多，有91份种质属于该种，15份种质属于Spirodela polyrhiza。7份种质属于Landoltia punctata。6份种质属于Wolffia globosa。atpF-atpH序列（A）和rpS16序列（B）分别用MacVector软件比对后，用MEGA6软件构建分子系统发育树。完全相同的序列用1条序列做代表，相同序列的数量在括号中标出。参考序列来自GenBank。

2.4 遗传多样性分析

利用DnaSP5软件分析福建浮萍种质的遗传多样性。结果表明福建浮萍种质的遗传多样性非常丰富，而且rpS16比atpF-atpH序列的多样性更大。基于atpF-atpH和rpS16的核苷酸多态性指数分别为0.035 13和0.051 23，每kb平均核苷酸差异数为20.374和44.675，群体突变率分别为0.036 40和0.051 64，单倍型多态性指数分别为0.577和0.617（表2）。稀脉萍、无根萍、多根紫萍基于atpF-atpH和rpS16的单倍型数分别为4、2、2（表3），这些多样性参数都高于海南岛浮萍的遗传多样性，且海南单倍型数分别为3、2、1、1[16]。地区之间的遗传多样性也存在差异，闽南地区浮萍遗传多样性高于闽北地区（表4、5）。闽南地区基于叶绿体atpF-atpH间隔序列的核苷酸多态性指数、每kb核苷酸变异数以及群体突变率分别是闽北地区的2倍以上。以科为单位和以单一浮萍（稀脉萍）属为单位进行遗传多样性分析的结果都支持闽南地区的遗传多样性高与闽北地区的结论（表4、5）。

3 讨论

全世界浮萍科植物有5属37种[1-3]，中国浮萍科植物可能有4属10种[15]，其中相关文献报道海南地区浮萍科发现4属4种，分别为浮萍属（Lemna）：稀脉萍（Lemna aequinoctialis），多根紫萍属（Spirodela）：多根紫萍（Spirodela polyrrhiza），少根紫萍属（Landoltia）：少根紫萍（Landoltia punctata），无根萍属（Wolffia）：无根萍（Wolffia globosa）[16-18]。江苏地区发现4属4种分别为浮萍属（Lemna）的青萍（Lemna perpusilla）；无根萍属（Wolffia）的无根萍（Wolffia globosa）；多根紫萍属（Spirodela）的多根紫萍（Spirodela polyrrhiza）；少根紫萍属（Landoltia）的少根紫萍（Landoltia punctata）[22]。浙江地区浮萍科发现3属5种分别为浮萍属：浮萍、品萍、稀脉萍；多根紫萍属：紫萍；无根萍属：无根萍[23]。本研究所发现的福建地区浮萍科种类与海南地区的相似。文献比较发现沿海地区浮萍属中都有稀脉萍，且浙江地区浮萍属中还发现浮萍和品萍，而其他几个沿海地区没有发现。

本研究根据6个形态学数量性状初步将福建浮萍种质分类到属，其中包括浮萍叶片大小、成簇叶片数、叶脉数、根数、根长、叶片颜色[16]，采用叶绿体atpF-atpH间隔序列以及rpS16内含子序列进行分子系统学鉴定，与GenBank数据库下载浮萍的参考序列进行分析比对，构建发育树[17]，将福建119份浮萍种质鉴定到种。其中，91个浮萍种质为稀脉萍（Lemna aequinoctialis），15个种质为多根紫萍（Spirodela polyrrhiza）；6个种质为无根萍（Wolffia globosa）；7个种质为少根紫萍（Landoltia punctata）。

DnaSP5.10.01软件是一个广泛使用的进行遗传多样性分析的软件。笔者用该软件对福建119个浮萍种质材料的DNA序列进行遗传多样性分析，其中主要分析群体突变率（θw）、平均核苷酸差异数（Kb）、单倍型多态性指数（Hd）以及核苷酸多态性指数（Pi）。结果表明，福建的浮萍种质存在丰富的遗传多样性，其结果如表2～5所示。其中rpS16比atpF-atpH序列的多样性更大。闽北与闽南地区浮萍科基于atpF-atpH和rpS16的核苷酸多态性指数分别为0.035 13和0.051 23，每kb平均核苷酸差异数为20.374和44.675，群体突变率分别为0.036 40和0.051 64，单倍型多态性指数分别为0.577和0.617（表2）。其中稀脉萍、无根萍和多根紫萍基于atpF-atpH和rpS16的单倍型数分别为4、2、2（表3）。这些多样性参数都明显高于海南岛浮萍的遗传多样性[17]。福建浮萍种质各项指标均高于海南岛浮萍的遗传多样性的原因在于多方面的因素，如气候、温度，地形等。福建气候属于亚热带湿润季风气候，主要特征为湿润温暖；受气候影响，光照充足，热量丰富，雨量也非常充沛，且全年平均气温在19.5～21.2 ℃左右。福建地形主要以山地丘陵为主，多山地少平原，多断层地貌，多河谷盆地典型特征，且受地质构造控制，形成了闽西大山和闽中大山相互平行带[19]。海南岛气候属于热带海洋季风气候，其主要特征为光热充足，降水丰富，且水热同期，全年平均气温在22.4～25.5 ℃左右。海南岛地形主要也是以山地丘陵为主，与台地、平原构成环形层状地貌，阶梯结构明显[20-21]。福建闽南遗传多样性大于闽北，两者相比较，地形变化不大，唯有影响两省浮萍种质遗传变异的因素可能为气候与温度的不同，并且可能还存在一些水质或者土质方面的因素，福建的土壤指标由于受不同的地理位置分为“热性”与“温性”，南部较北部土壤中所富含的铝特性较强，盐基不饱和[24]。由于浮萍容易受到自然环境因素的影响而改变自身的形态，并且发生基因的改变，故而综上所述福建闽南浮萍的遗传多样性大于闽北，可能性最大的因素是温度、气候、地理位置以及关照强度所导致浮萍遗传多样性变化。

福建119份浮萍种质中浮萍属分布最多，最广泛，故遗传多样性也相对其他属类要丰富。不同的种类，不同地区的浮萍，生物学特性也存在差异性。随着全球能源的需求量不断上涨，以往能源乙醇燃料开发均采用粮食作物来生产，造成人类粮食的短缺。浮萍有生长快，不争粮等特點，是一种优质的能源水生植物，近年来已经有研究人员研究浮萍提炼乙醇[12-14]。不同浮萍的种质有不同的性状，对福建浮萍种质的遗传多样性研究和筛选有着重要的理论和应用价值，为今后的生物能源研究奠定基础。

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