高温胁迫对华石斛幼苗的形态和生理参数的影响

吴姝漪 孟千万 宋希强 丁琼 朱婕 余文刚 马豪治

摘 要 华石斛为海南特有兰科植物，原产海南海拔1 000 m以上的云雾林或山地雨林。为研究高温对华石斛生长的影响， 本试验测定了昼/夜（10 h/14 h）温度梯度（25/20、30/25、35/30、40/35 ℃）的人工气候箱中生长1、2、4、8 d以及解除胁迫15 d（恢复生长）后华石斛幼苗的形态和生理生化指标。结果表明：高温30 ℃和35 ℃处理1 d时，形态和各项生理生化指标变化不显著，幼苗没有受到热害。30 ℃和35 ℃处理2～4 d和40 ℃处理1～2 d时，细胞膜稳定性遭到破坏，导致膜脂过氧化，相对电导率、MDA含量升高，SPAD值下降，此时植物通过增加可溶性糖、可溶性蛋白含量，提高SOD、POD活性进行自我调节。30、35 ℃处理8 d和40 ℃处理4 d时，各项生理指标急剧下降，膜系统和抗氧化酶系统遭到破坏，植物受到严重热害。40 ℃处理8 d时，95%的幼苗褐化死亡。不同处理天数下温度均与相对电导率和MDA含量呈极强正相关，与SPAD呈负相关。研究认为，相对电导率、SPAD、MDA可作为鉴定华石斛幼苗耐热性的参考指标。

关键词 华石斛；热胁迫；形态变化；生理反应；耐热性

中图分类号 S682.31 文献标识码 A

Abstract High temperature is a major bottleneck in the cultivation of Dendrobium sinenese habiting the tropical cloud forest or montane rainforest with altitudes above 1 000 m in Hainan Island， China. To investigate how D. sinense responses to heat stress， morphological and physiological indices were measured for the seedlings grown under four temperatures， i.e.， 25/20（control）， 30/25， 35/30 and 40/35 ℃ and a day/night cycles of 10 h/14 h for 1， 2， 4， 8 d， and recovery for 15 d. Our results showed that no significant differences in morphological， physiological and biochemical changes were found in the seedlings under 30 ℃ and 35 ℃ for 1 d， while damage of cell membrane stability， resulting in membrane lipid peroxidation， increased relative conductivity and MDA content， and decreased SPAD value were observed under 30 ℃ or 35 ℃ for 2-4 d or 40 ℃ for 1-2 d. However， the damaged seedlings were still able to recover through increasing the content of soluble sugar and soluble protein， and raising the SOD， POD activities. Severe heat damages on the membrane system and antioxidant enzyme system indicated by sharply decreases in physiological indices were observed in the seedlings under 30， 35 ℃ for 8 days or 40 ℃ for 4 days. When being treated at 40 ℃ for 8 days， 95% of the seedlings turned brown and died. Our studies demonstrated that the relative conductivity and MDA content were positively correlated， while the SPAD value was negatively correlated with temperatures. Therefore， these three values could be used as heat tolerance index of D. sinense seedlings.

Key words Dendrobium sinense； heat stress； morphological change； physiological response； heat tolerance

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.04.010

華石斛（Dendrobium sinense）原产于海南岛中西部海拔1 000 m以上的高山云雾林或山地雨林中，是海南特有兰科植物，也是传统黎药[1]。华石斛全草富含芪类、联苄类等多类化合物，具有良好的抗菌、抗肿瘤活性[2]。将华石斛引种到气温相对较高的低海拔地区栽培过程中发现，持续高温条件下华石斛植株易出现萎蔫、落叶、褐化甚至死亡，这可能是由于华石斛长期适应海拔较高地区冷凉的生境，从而对环境温度变化极其敏感[3]，但高温对华石斛的影响尚未被揭示。

短暂或持续的高温影响植物的生长和发育，严重可导致植物体死亡[4]，植物的热应激反应引起一系列形态和生理生化的变化从而缓解高温带来的胁迫[5]。高温引发五叶地锦[6]（Parthenocissus quinquefolia）、南蛇藤（Celastrus obiculatus）等植物细胞脱水，叶绿素的生物合成受阻、分解加速，植物叶片的SPAD值降低；万寿菊（Tagetes erecta）[7]受热害后细胞原生质膜透性增加，电解质外渗，相对电导率增加；植物在高温胁迫下通过合成或分解可溶性蛋白和可溶性糖等渗透调节物质，帮助维持细胞的渗透压，提高对环境的适应性[8]；丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的最终产物，高温处理芍药（Paeonia lactiflora）后，叶片中的MDA含量增加，MDA含量是判断植物受热害程度的可靠指标之一[9]；抗氧化酶SOD、POD和CAT等可以在一定范围内清除高温胁迫产生的活性氧自由基，降低膜脂过氧化，有效提高植物的耐热性[10]。

本研究将华石斛幼苗置于不同梯度的人工高温条件下培养，观测其外观形态并检测生理生化指标的变化情况，拟探究高温胁迫对华石斛幼苗形态的影响，高温胁迫对华石斛幼苗生理参数的影响，反映华石斛幼苗耐热性的主要参考性指标。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2016年6月～2016年9月在海南大学进行。供试材料是通过无菌播种得到的整齐一致的一年生华石斛（Dendrobium sinense）幼苗，株高4～5 cm；具4～6片叶，叶色正常；具1～4条根，根长1～4 cm。

将幼苗带瓶置于海南大学基地大棚的苗床上自然条件下生长10 d，取出华石斛幼苗，用去离子水轻轻洗去根部的培养基后用1/1 000的多菌灵浸泡3 min，用洁净的吸水纸将幼苗上的水分吸干。放置1 d后，观察幼苗根部发白，移栽至10 cm×8 cm ×8 cm的方形塑料容器内，基质采用消毒和腐熟过的陶粒 ∶ 碎树皮 ∶ 水苔=1 ∶2∶ 1，每盆栽30株。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 实验材料预处理：处理前先将所有盆栽幼苗置于昼/夜分别为25 ℃/15 ℃，10 h/14 h，相对湿度为80%～85%，光照强度为2 000 lx的人工智能培养箱（HENGZI SPX-250）中预处理10 d。

高温胁迫试验：依据海南省气象局气象服务中心发布的数据资料[11]和预实验研究结果，试验设昼/夜温度25 ℃/20 ℃、30 ℃/25 ℃、35 ℃/30 ℃、40 ℃ /35 ℃，每个温度下的幼苗分别于1、2、4、8 d后取出拍照并剪取新鲜叶片供生理生化指标分析，以25 ℃/20 ℃为对照。每个处理3盆共90株苗，取样时每盆随机取15株幼苗，剩余幼苗做好标记放入培养箱，条件同预处理，做高温胁迫后的恢复。

恢复生长试验：基于预实验研究结果，各处理分别于解除胁迫15 d后取样测定各项生理生化指标。

1.2.2 测定方法 SPAD值用SPAD-502Plus叶绿素仪测定，选择幼苗的第2～4片真叶，每处理测定30个数据；用DDS-11A数显电导率仪测定叶片浸出液的电导率，用相对电导率（RCE）表示膜的受伤害程度；其他指标测定参考《植物生理生化实验原理和技术》[12]，丙二醛（MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸法；可溶性糖（SS）含量测定采用蒽酮比色法；可溶性蛋白（SGS）测定采用考马斯亮蓝G-250染色法；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑法测定；过氧化氢酶（CAT）活性采用紫外吸收法测定；过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚氧化法测定。测量仪器使用T6新世纪紫外可见分光光度计，每个指标3个重复取其平均值。

高温胁迫SPAD变化值=高温处理后各处理SPAD值-预处理后各处理SPAD值。

恢复生长SPAD变化值=恢复生长后各处理SPAD值-预处理后各处理SPAD值。

1.3 数据处理

数据用SPSS 18.1进行差异显著性分析，采用单因素（one-way ANOVA）和Duncan法（α=0.05）；用Canoco 5.0进行冗余分析（RDA）。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫及恢复生长下华石斛幼苗的形态特征

随着温度升高和胁迫时间延长，华石斛幼苗的受害程度不断加深。30 ℃和35 ℃处理1 d，幼苗与CK（对照，25 ℃/20 ℃）差别不大；高温30 ℃和35 ℃ 处理4 d后，幼苗叶片出现萎蔫、发黄、烧尖、褐化和掉落现象；35 ℃处理8 d和40 ℃处理4 d时植株褐化严重，茎基部腐烂；40 ℃处理8 d时95%的幼苗整株萎蔫枯死，故该处理下生理生化指标仅能够测定SPAD值和相对电导率（图1-A）。

高温胁迫解除15 d后，30 ℃和35 ℃处理1～2 d的幼苗有分蘖现象；30 ℃和35 ℃处理4～8 d的幼苗葉片萎蔫，烧尖、黄化和褐化现象无法恢复，恢复期持续落叶；40 ℃处理1 d的幼苗叶片萎蔫蜷曲，处理2～4 d的幼苗叶片褐化、掉落，茎基部腐烂；40 ℃处理8 d的幼苗整株褐化枯死（图1-B）。

2.2 高温胁迫和恢复生长下华石斛幼苗的生理特征

2.2.1 高温胁迫下华石斛幼苗的生理特征 随着胁迫的不断加深，幼苗叶片的SPAD值呈现出不同程度的下降（图2-A），胁迫温度越高、胁迫时间越长，下降速度越快。30、35、40 ℃处理8 d相比预处理时，SPAD分别下降了20.5%、10.5%、59.0%；在25 ℃处理8 d时，SPAD值有上升的趋势，达到预处理时的108.6%。

相同温度下随处理时间的增加，电导率曲线趋势呈初期较平直，后期为只升不降的半抛物线，胁迫程度越深电导率越大。40 ℃处理2 d时，与对照差异显著；4 d的所有高温处理均与对照差异显著；40 ℃处理8 d时，相对电导率达到所有处理中的最大值76.7%（图2-B）。

MDA含量與相对电导率趋势较一致，但在35 ℃处理8 d和40 ℃处理2 d时，MDA含量急剧下降。30、35和40 ℃分别处理8、4和1 d时，MDA含量分别达到其相同温度各处理中的峰值，分别比对照增加了193.27%、219.97%、202.05%（图2-C）。

可溶性蛋白（图2-D）在不同温度下含量随时间的变化消长动态有所不同，分别在高温30 ℃处理4 d、35 ℃处理2 d和40 ℃处理1 d时含量最高，分别比对照增加了55.0%、67.5%和12.6%；高温胁使可溶性糖（图2-E）的含量有所增加，高温处理30、35和40 ℃时其含量分别在胁迫4、2和1 d时达到峰值，分别比对照增加了33.8%、35.9%和40.0%。

高温胁迫程度较轻时，SOD、POD和CAT酶的活性（图2-F～H）整体呈增加趋势，但是随着胁迫温度的增加和胁迫时间的延长，三者活性开始出现下降。SOD的活性分别在30 ℃处理2 d、35 ℃处理2 d和40 ℃处理1 d时达到峰值，分别比相应对照增加了227.5%、161.6%和143.3%；POD在30 ℃处理4 d、35 ℃处理1 d和40 ℃处理2 d时达到峰值，分别比相应对照增加了32.0%、75.1%和84.9%；CAT的活性分别在30 ℃处理4 d、35 ℃处理1 d和40 ℃处理1 d时达到峰值，分别比相应对照增加了36.9%、2.4%和23.4%。

2.2.2 恢复生长后华石斛幼苗的生理特征 恢复生长15 d后，高温胁迫过1 d的幼苗在40 ℃高温处理的各项生理生化指标均与对照差异显著；30 ℃处理的各指标与对照差异不大，恢复情况较好。高温胁迫2 d后再恢复，不同温度处理下幼苗的MDA含量（图3-C）和SOD（图3-F）活性均有向CK靠近的趋势；40 ℃处理的可溶性糖含量（图3-E）较高温处理时有所上升。高温胁迫4 d后再恢复，30 ℃和35 ℃高温处理的幼苗MDA含量、相对电导率（图3-B）有所回落但仍维持在较高水平，与对照差异显著；40 ℃处理下相对电导率急速升高，甚至超过胁迫时达到67.76%。高温处理8 d的幼苗恢复生长15 d后，30 ℃和35 ℃处理的SPAD（图3-A）仅达到预处理时的85.9%、82.6%，此时25 ℃处理的SPAD值则达到了预处理的1.25倍。

2.3 华石斛幼苗生理指标受高温胁迫的冗余分析（RDA）

处理1～2 d时，高温对各生理指标即可产生显著的影响，这一时期，高温下生长的华石斛幼苗主要表现为对电导率、可溶性糖含量、MDA含量、SOD活性和POD活性相对较高，而SPAD相对较低。此外，可溶性蛋白含量和CAT活性受温度的影响较小。处理4～8 d后，高温使华石斛幼苗的相对电导率、MDA含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量等生理指标升高，而SPAD、CAT、SOD和POD活性等生理指标随温度增高而降低（图4）。

3 讨论

3.1 高温胁迫下华石斛幼苗的形态特征

高温抑制华石斛正常的生理代谢，导致其叶片出现萎蔫、失绿、掉落等外部形态的变化。本试验中30 ℃和35 ℃持续4 d以上的高温和40 ℃的极端高温，引起华石斛叶片萎蔫、褐化和落叶，甚至全株枯死，与其他植物在高温下的表现相同[13]。推测华石斛幼苗对高温极为敏感，对持续高温或极端高温抵御能力差。

3.2 高温胁迫对华石斛幼苗生理参数的影响

叶绿素含量是反映植物光合能力和健康状态的重要指标[14]，本研究中，所有高温处理下的幼苗SPAD值均有所下降，并且处理温度愈高、处理时间愈长，SPAD值下降越快，该结果与林晓红等[15]对兰科金线莲（Anoectochilus roxburghii）的研究结果一致，反映高温造成华石斛叶绿素分解破坏。已有研究表明高温导致膜透性增加和膜脂质过氧化[16]，华石斛受高温胁迫后相对电导率持续增加，恢复生长15 d后MDA含量变化不大，这与大多数研究者的结论相同[17]，初步推测华石斛的抗逆性较弱。本研究中，可溶性糖、可溶性蛋白含量和SOD、CAT、POD酶活性受温度影响，且在胁迫初期（1～2 d）时均与温度正相关，这符合植物在逆境下的一般反应[18]；持续胁迫时SOD、POD、CAT活性出现下降，这可能是由于不断加剧的高温伤害到了酶本身[19]。华石斛幼苗通过协调体内营养物质、渗透调节物质和保护酶活性等的动态平衡，增强抗热性，从而减轻高温带来的伤害[20]，是其对高温胁迫的适应性反应和耐热生存的重要调节机制。

3.3 华石斛幼苗耐热性生理鉴定指标的选择

胁迫初期，温度对各种生理指标的影响主要表现在相对电导率、MDA含量、可溶性糖含量、SOD活性等增加，而SPAD减少，CAT活性受温度影响不大（图4）；持续胁迫导致相对电导率和MDA含量大幅增加，可溶性糖和可溶性蛋白合成来维持细胞渗透势，抗氧化酶系统遭到破坏，表现为SOD、POD和CAT活性与温度呈负相关。这表明高温对华石斛幼苗的SPAD、CAT有一定的抑制作用，对相对电导率、MDA、可溶性糖和可溶性蛋白含量的增加有一定的诱导作用，且其中SPAD、相对电导率和MDA含量变化明显，可将其作为华石斛幼苗的耐热性生理鉴定指标，这与李威等[21]的研究结果一致。

温度几乎会影响植物的整个生长发育过程。本研究初步探究了华石斛出瓶组培幼苗在高温下的形态和生理特征，高温对华石斛成年植株和野生植株的影响还有待进一步的研究。

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