SSR分子标记分析CIP引进马铃薯品系与国内资源的遗传差异

宋洁　郭华春　李婉琳　姚超

摘要：【目的】分析國际马铃薯中心（CIP）引进的马铃薯品系与国内资源的遗传差异，为马铃薯遗传资源的保存及育种利用提供参考依据。【方法】利用14对SSR引物对从CIP引进的32份马铃薯品系与35份国内资源进行聚类分析和主坐标分析。【结果】选取的14对引物目标条带清楚，多态性高，多态信息量（PIC）变幅为83.70%～96.03%，平均为92.62%。所有供试材料的遗传相似系数范围为0.3167～0.8333，平均为0.5763；国内材料的遗传相似系数范围为0.4833～0.7667，平均为0.5867。聚类分析结果表明，在遗传相似系数0.6000处可将试验材料分为六大类，第一类和第二类均包括18份材料，主要为从CIP引进的马铃薯品系；第三类包括5份材料，包括CIP引进马铃薯品系1份（D172）和国内马铃薯品种（系）4份（昆-3、云201、克疫85和紫云2号）；第四、五、六类分别包括7、10和8份材料，均为国内马铃薯品种（系）。主坐标分析可将所有材料分为两大类，第一类包括25份国内马铃薯品种（系），第二类包括10份国内马铃薯品种（系）和31份从CIP引进的马铃薯品系，其结果与相似性系数在0.5360处的聚类分析结果相符，可直观反映马铃薯资源类群。【结论】从CIP引进的马铃薯新品种（系）与国内现有品种（系）遗传距离较远，可丰富国内马铃薯种质资源，有较高的应用潜力。

关键词： 马铃薯；SSR分子标记；遗传差异；聚类分析；主坐标分析

中图分类号： S532 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）04-0567-07

Abstract：【Objective】In this study， genetic differences between potato strains introduced from International Potato Center（CIP） and domestic potato resources were analyzed， in order to provide reference for preservation and breeding of potato genetic resources. 【Method】Cluster analysis and principal coordinate analysis for 32 CIP potato strains and 35 domestic potato resources were conducted based on 14 SSR primer pairs. 【Result】The 14 primer pairs contained clear target bands and high polymorphism. Polymorphism information content（PIC） ranged from 83.70% to 96.03% and was 92.62% in average. Genetic similarity coefficient of all materials was 0.5763 in average， ranging from 0.3167 to 0.8333. Genetic similarity coefficient of domestic resources varied from 0.4833 to 0.7667， and averaged 0.5867. Cluster analysis indicated that the materials could be clustered into six groups by the similarity coefficient of 0.6000. Group Ⅰand Ⅱ contained 18 materials which were mainly potatoes introduced from CIP. Group Ⅲ was consistent of five materials， one CIP potato strain（D172） and four domestic varieties（strains）（Kun-3， Yun 201， Keyi 85 and Ziyun 2）. Group Ⅳ，Ⅴ and Ⅵ contained seven， ten and eight materials respectively and they were all domestic potato varieties（strains）. Principal coordinate analysis divided them into two groups， one contained twenty-five domestic potato varieties（strains） and the other contained ten domestic varieties（strains） and thirty-one PIC potato varieties（strains）. This result was in accordance with that when similarity coefficient was 0.5360， and could reflect the potato resource groups intuitively. 【Conclusion】The genetic distance between potato varieties（strains） introduced from CIP and domestic varieties（strains） is far. Therefore CIP potato varieties（strains） can enrich domestic potato resources and contain promising application potential.

Key words： potato； SSR molecular marker； genetic difference； cluster analysis； principal coordinate analysis

0 引言

【研究意义】云南省是我国马铃薯主产区，但目前云南省马铃薯品种单一，缺乏优质新品种，引种是丰富种质资源的有效途径（梁武和张德亮，2015）。从马铃薯生长特性来看，短日低温可促进结薯，若从北方长日照地区引种到南方短日照地区，对地下块茎的生长会有一定影响（常志敏，2007）。国际马铃薯中心（CIP）作为世界马铃薯基因库，保存有丰富的抗病基因资源，特别是抗晚疫病和抗青枯病系列，是云南马铃薯育种中急需得到的基因资源。CIP所在地秘鲁与云南省的生态条件相似，因此从CIP引进马铃薯品系对云南的气候环境有较好的适应性（杨万林和隋启君，2003），但在块茎性状、生育期、休眠期等性状上存在明显的缺点，难以直接广泛应用于生产。通过品种改良和选育可让CIP材料在云南马铃薯育种中发挥更高的价值，使云南马铃薯资源不断丰富、品种选育的能力不断提高（杨万林和隋启君，2005）。因此，研究从CIP引进马铃薯品系与国内资源的遗传差异，对马铃薯育种中的亲本选配具有重要意义。【前人研究进展】近年来，分子标记已广泛应用于各类作物遗传差异分析。与其他分子标记相比，SSR分子标记具有高多态性、特异性强、分布广和成本低等优点，已成为遗传作图、种质鉴定、基因定位、分子标记辅助选择育种和遗传差异分析常用的手段（Lan et al.，2012；Carputo et al.，2013；倪先林等，2015；阴云伙等，2015）。白建明等（2010）采用SSR分子标记对经过超低温保存后的马铃薯再生植株进行遗传稳定性检测，结果表明再生植株的遗传稳定性未发生改变。李先平等（2012）利用3l对SSR引物区分了30份彩色马铃薯品种。石景等（2012）利用5对SSR核心引物构建了50份彩色马铃薯品种的指纹图谱。黄先群等（2014）利用9对SSR引物对12个引进品种、12个费乌瑞它自然和辐射变异材料进行遗传多样性分析，结果表明，品种间的多态性和遗传距离大于变异材料。Song等（2016）利用SSR分析192个马铃薯栽培品种的遗传差异，结果发现马铃薯栽培品种遗传基础较狭窄，可利用引种等手段丰富马铃薯栽培种。【本研究切入点】虽然目前国内外已有学者利用SSR分子标记对马铃薯遗传差异进行较多研究，但将国内马铃薯品种（系）与CIP品系结合起来共同分析遗传差异的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】以CIP引进的32份马铃薯新品系和35份国内马铃薯品种（系）为材料，利用SSR分子标记分析其遗传差异及亲缘关系，以期为马铃薯遗传资源的保存及育种利用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验材料包括从CIP引进的32份马铃薯新品系和云南农业大学薯类研究所提供的35份国内马铃薯品种（系）（表1）。于2015年1月采集供试材料的组培苗，置于-80 ℃冰箱贮藏，以备提取基因组DNA。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 基因组DNA提取 称取约0.1 g组培苗，参照Moisan-Thiery等（2005）的方法提取基因组DNA，略有改进。将装有组培苗的离心管加液氮后迅速研磨成粉末，立即加入65 ℃预热的2% CTAB，提取缓冲液[1.4 mol/L NaCl、20 mmol/L EDTA、100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、0.2% β-ME]1 mL，緩慢颠倒混匀后65 ℃水浴1 h；12000 r/min离心10 min后取上清液抽提，后续步骤继续参照Moisan-Thiery等（2005）的方法。提取的DNA以2 μL 50 ng/μL λDNA为对照，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后用1×TE稀释至终浓度为50 ng/μL备用。

1. 2. 2 SSR分析 SSR反应体系和程序参照Ghislain等（2004）的方法。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，退火温度退火45 s，72 ℃ 1 min，进行35个循环；72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。扩增反应在Biometra PCR仪上进行，产物用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色。PCR引物来自公开发表的文献（Ghislain et al.，2004；Feingold et al.，2005），从58对引物中选取14对多态性好的引物（表2），由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1. 3 统计分析

用数码相机进行拍照，根据图谱中条带的有无，在相同迁移率位置上有带的记为1，无带的记为0，组成一个原始数据矩阵。利用NTSYS-pc 2.10e的SM系数法计算得到14对引物检测的供试材料遗传相似性系数。利用SAHN程序，采用UPGMA方法对SSR数据进行聚类分析，并通过Tree plot生成聚类分析图。

2 结果与分析

2. 1 SSR引物多态性分析结果

采用14对SSR引物对供试样品进行扩增，其中引物sti024扩增结果见图1。由表3可知，14对引物扩增产物的片段大小在78～250 bp，共扩增出60条多态性条带，每对引物扩增的条带数为3～6条不等，平均每对引物约扩增出4条。其中，引物sti053和sti033扩增出的条带数最多，各有6条；引物stm13扩增出的条带数最少，仅为3条。所有引物的多态性比率变幅为33.33%～100.00%，平均为66.38%；所有引物的多态信息量（PIC）变幅为83.70%～96.03%，平均为92.62%。

2. 2 聚类分析结果

通过NTSYS-pc 2.10e生成能显示各品种（系）间遗传关系的树状图（图2），结果表明，在0.6000处可将材料大致分为六大类：第一类共18份材料，包括14份从CIP引进的马铃薯品系和4份国内马铃薯品种（系）（丽薯6号、青薯9号、尤金和宣薯2号）；第二类共18份材料，包括16份从CIP引进的马铃薯品系和2份国内马铃薯品种（系）（大西洋、合作88）；第三类共5份材料，包括1份从CIP引进的马铃薯品系（D172）和4份国内马铃薯品种（系）（昆-3、云201、克疫85和紫云2号）；第四、五、六类分别包括7、10和8份材料，全部为国内马铃薯品种（系）。所有供试材料的遗传相似系数范围在0.3167～0.8333，平均为0.5763；国内材料的遗传相似系数范围为0.4833～0.7667，平均为0.5867。由此可见，引进的新品系扩宽了国内的遗传相似性系数，丰富了国内的种质资源。

2. 3 主坐标分析结果

主坐标分析以品种间的相似性系数矩阵为依据，建立坐标系，不同品种（系）在主坐标图中的位置可反映出品种（系）间的亲缘关系，品种（系）间距离越近表明其遗传相似性越大，亲缘关系也越近，反之，则表明遗传差异越大，亲缘关系越远（高山等，2007）。利用NTSYS-pc 2.10e，基于聚类分析计算出的遗传相似系数，经主坐标分析三维图（图3），可将供试材料分为两大类，第一类是Dim-1坐标-0.44～-0.04范围内的25份国内马铃薯品种（系），第二类是Dim-1坐标-0.04～0.35范围内的41份材料，包括10份国内马铃薯品种（系）和31份从CIP引进的马铃薯品系。这一结果与相似性系数在0.5360处的聚类分析结果相符。说明主坐标分析可直观反映马铃薯资源类群，但在杂交育种上还需依靠聚类分析结果和育种家的经验进行亲本选配。

3 讨论

本研究选用14对SSR分子标记对67份国内外马铃薯品种（系）进行遗传差异分析，在试验中剔除了PCR扩增目标条带不稳定、多态性不高的引物后，最终选用的SSR引物目标条带清晰、多态性好且PIC大于50.00%。Botstein等（1980）研究表明，引物为高度多态性的条件是PIC大于50.00%，且PIC接近于100.00%的位点是试验所需。本研究中PIC最小值为83.70%，满足上述条件，说明选取的引物均为高度多态性引物，具有代表性，能更好地反映供试品系的遗传差异水平。其中sti004位点的PIC为96.03%，与刘文林等（2016）研究发现sti004位点上表现出较高的遗传多样性，可用于俄罗斯马铃薯品种遗传多样性检测的结论一致。

目前，我国四川、贵州、青海、甘肃、内蒙古等地的马铃薯种质资源均缺乏，种质的遗传多样性均不高（滕长才等，2009；李飞等，2010；唐铭霞等，2010；颜谦等，2016）。本研究引进的32份CIP马铃薯品系可扩宽国内遗传相似性系数范围，解决长期以来国内马铃薯资源遗传基础狭窄的问题，与刘文林等（2016）的研究结果基本一致；且从聚类分析图上看，在0.5360处，31份CIP材料聚为一类，另外10份虽为国内马铃薯品种，但探究其亲缘关系不难发现，其父母本之一也是CIP品系（如合作88的親本之一是CIP品系），该现象进一步证实了聚类分析结果的可靠性。在引进的32份材料中有一份材料较特殊，为D164，该材料单独聚在一个分支，出现这一现象还需进一步研究。32份从CIP引进的马铃薯品系与国内部分品种（系）遗传距离较远，亲缘关系也较远，从育种上看，引进的品系可与国内品种（系）作亲本进行杂交，选育优良后代，且在今后的研究中可选择从CIP引进的32份马铃薯新品系和35份国内马铃薯品种（系）作为亲本进行杂交，以进一步验证材料的遗传稳定性。

4 结论

从CIP引进的马铃薯新品系与国内现有马铃薯品系遗传距离较远，可丰富国内马铃薯种质资源，有较高的应用潜力。

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（责任编辑 罗 丽）