微生物酯酶用于检测有机磷农药残留的研究

黄欢 黄敬洲

【摘 要】文章主要研究利用微生物乙酰胆碱酯酶抑制法开展蔬菜农药残留检测。通过使用超声波、渗透压、溶菌酶等方法，从微生物中提取对有机磷农药敏感的微生物酯酶。根据有机磷农药能够抑制胆碱酯酶的机理，用比色法测定酶的活性。结果表明：酶促反应最佳条件是反应时间为15 min、反应温度为35 ℃、pH值为7.4。选用5种有机磷农药（敌百虫、甲胺磷、氧化乐果、乙酰甲胺磷、敌敌畏）对乙酰胆碱酯酶的抑制作用进行了研究。结果表明：农药浓度在0.1～20 ppm的范围内，农药对乙酰胆碱酯酶的抑制率随浓度的升高而增大。此外，文章还分析了温度、pH值、金属离子对该酯酶活力的影响。结果表明：该酯酶在低于40 ℃的条件下稳定，pH值稳定范围为7.4～8.0；Cu2+有明显的抑制作用，EDTA有较低的抑制作用，Ca2+、Mg2+、Mn2+则有一定程度的激活作用。

【关键词】有机磷；农药残留；微生物酯酶；酶抑制法

【中图分类号】X839.2 【文献标识码】A 【文章编号】1674-0688（2017）06-0068-03

随着生产的发展，农药已经成为农业生产十分重要的生产因素，它的广泛应用为人类创造了巨大的经济利益，也促进了农业生产的发展。农药的使用已经在农业生产中成为必然，并且在将来农业的发展依然离不开农药。但是农药也会对环境和人类自身造成一定的危害[1]，农药在食品上的残留更是引起人们的广泛关注。农药残留量超标，直接影响着人们的身体健康、出口贸易及农民收入的提高，严重阻碍了农业的可持续发展。建立一套快速和有效的农药残留检测方法显得尤为重要，这样就可以对农药加以控制，减少和降低农药对环境和人类的威胁[2]。

为了更有效地建立有机磷及氨基甲酸酯类农药的检测方法，本实验对微生物的胆碱酯酶进行了酶学性质的研究，包括最适反应pH值、最适反应温度、在不同温度和不同pH值之下的稳定性、金属离子对酶活力的影响等。

1 胆碱酯酶的提取

对实验室包藏菌种进行破胞取酶，用3种方法进行破胞：超声波、渗透压和溶菌酶。取3管菌液进行超声波破胞，超声波时间分别为2 min、3 min和5 min，再测定破胞后的酶活力，选出最佳超声波时间。再用4管菌液进行渗透压破胞，渗透压的蔗糖浓度分别为15%、20%、25%和30%，再测定破胞后的酶活力，比较出最佳渗透压浓度。再用4管菌液进行溶菌酶破胞，溶菌酶浓度分别为0.3 mg/L、0.5 mg/L、0.8 mg/L和1.0 mg/L，测定4管破胞后的酶活力，比较出最佳反应浓度。再通过3种破胞方法的比较，选择出酶活力最高的实验条件进行破胞取酶。

2 胆碱酯酶酶活的检测方法

采用分光光度法：以缓冲液稀释靛酚乙酸酯（红色）2.5倍作为底物，乙酰胆碱酯酶将靛酚乙酸酯水解成靛酚（蓝色）和乙酸。靛酚在605 nm的可见光处有吸收峰，根据其OD值改变量确定酶的相对活性。

实验中，在EP管加入10μL胆碱酯酶、450μL缓冲液和50μL靛酚乙酸酯，混匀，于37 ℃水浴中反应20 min，加入500μL 95%的乙醇，混匀，取500μL于比色皿中，加入2.5 mL蒸馏水，混匀，测定OD605。

计算公式如下：

胆碱酯酶相对酶活=ΔOD/ΔODmax×100%（1）

公式（1）中：ΔOD為酶反应液OD与对照OD之差；ΔODmax为酶反应液OD与对照OD之差的最大值。

2.1 pH值对胆碱酯酶活力的影响

配制不同pH值的Na2HPO■柠檬酸缓冲液（0.2 mol/L，pH值为4.0～9.0）。在EP管中加入10μL胆碱酯酶、450μL缓冲液和50μL靛酚乙酸酯，混匀。改变缓冲液的pH值，于37 ℃水浴保温10 min，加入500μL 95%的乙醇，混匀，测定OD605。

2.2 温度对胆碱酯酶活力的影响

在EP管中加入10μL胆碱酯酶、450μL的Na2HPO■柠檬酸缓冲液（0.2 mol/L，pH值为7.6）和50μL靛酚乙酸酯，混匀。在不同温度（20～50 ℃）的水浴保温20 min，加入500μL 95%的乙醇，混匀，测定OD605。

2.3 胆碱酯酶在不同温度下的稳定性

将10μL胆碱酯酶分别于不同的温度（20～70 ℃）水浴保温20 min，加入450μL的Na2HPO■柠檬酸缓冲液（0.2 mol/L，pH值为7.6）和50μL靛酚乙酸酯，混匀，于37 ℃水浴保温20 min，加入500μL 95%的乙醇，混匀，测定OD605。

2.4 胆碱酯酶在不同pH值下的稳定性

配制不同pH值的Na2HPO■柠檬酸缓冲液（0.2 mol/L，pH值为4.0～9.0）。将10μL胆碱酯酶分别于不同pH（2.2～9.0）37 ℃水浴保温20 min，将pH调至7.6，加入50μL靛酚乙酸酯，混匀，于37 ℃水浴保温20 min，加入500μL 95%的乙醇，混匀，测定OD605。

2.5 金属离子对酶活力的影响

加入100μL二价金属离子溶液于不同的EP管中，加入10μL胆碱酯酶、450μL Tris-HCl缓冲液（5 mmol/L，pH值为8.0）和50μL靛酚乙酸酯，混匀，于37 ℃水浴保温20 min，加入500μL 95%的乙醇，混匀，测定OD605，计算金属离子对胆碱酯酶的抑制率。

抑制率的计算公式如下：

I=（Uo-UI）/Uo×100%（2）

公式（2）中：Uo为未受抑制时胆碱酯酶的活力；UI为受金属离子抑制时胆碱酯酶的活力。

2.6 不同浓度的农药对胆碱酯酶活力的影响

用蒸馏水将农药标样分别稀释到一定浓度。取100μL不同浓度的农药溶液，加入10μL胆碱酯酶，混匀，于37 ℃水浴保温20 min，再加入450μL的PB（pH值为7.6）和50μL靛酚乙酸酯，混匀，在37 ℃水浴保温20 min，加入500μL 95%的乙醇，混匀，测定OD605，计算农药对胆碱酯酶的抑制率。以农药浓度为横坐标，胆碱酯酶的抑制率为纵坐标，绘制不同农药的抑制曲线。

抑制率的计算公式如下：

I=（Uo-UI）/Uo×100%（3）

公式（3）中：Uo为未受抑制时胆碱酯酶的酶活力；UI为受农药抑制时胆碱酯酶的酶活力。

3 结果与分析

3.1 胆碱酯酶粗酶活力的测定

使用超声波、渗透压和溶菌酶3种方法从微生物中提取胆碱酯酶，并改变各方法的反应条件，再比较所提取的酶活力，选择最佳的提取条件。

比较3种提取方法，活力最高的为超声波，使用超声波2 min提取胆碱脂酶是最佳的选择。但是，超声波提取方法提取量低，只适合实验室提取，如果是大量提取，应该选择容易操作的渗透压方法较好。

3.2 pH值对胆碱酯酶活力的影响

酸、碱既能影响酶的稳定性，也能直接影响酶的催化活性。因此，本实验对酶促反应的最适pH值碱酯酶活力较高，酶活力在80%以上；在45 ℃以后，酶活力显著下降，剩余酶活在10%以下。

3.4 胆碱酯酶在不同温度下的稳定性

丁诗华等人[36]报道，不同来源的胆碱酯酶热稳定性不同，热稳定性越好则该酶越不易失活，越有利于酶的保存。本实验将胆碱酯酶在不同温度（20～45 ℃）水浴保温20 min，研究其酶活力的變化情况。

胆碱酯酶在20～25 ℃保温20 min，酶活力基本不变，胆碱酯酶剩余酶活都在80%以上。随着温度的升高，酶的活性逐渐降低，在35 ℃保温20 min，活力下降45%；在40 ℃保温20 min，活力下降63%；在50 ℃保温20 min，剩余酶活只有15%，说明胆碱酯酶对热不稳定，仅在低于25 ℃的条件下稳定。

3.5 胆碱酯酶在不同pH值下的稳定性

酶的活性受酸碱的影响很大，同时酸碱还会影响到显色反应的程度、显色时间以及显色稳定性。本反应是一个酶催化作用下的显色反应，因此保持酶的活性至关重要，过强的酸碱性对酶的活性都会起到破坏作用。本实验将胆碱酯酶在不同pH（pH值为4.0～9.0）下保温20 min，研究其酶活力的变化情况，

胆碱酯酶在pH值为7.4～8.0时，酶活力基本不变，胆碱酯酶剩余酶活都在90%以上；而在pH值为4.0～5.0时，剩余酶活在30%～50%；在pH值为8.6时，活力下降40%；在pH值为9.0时，剩余酶活仅剩42%。这说明胆碱酯酶在不同pH值下的稳定范围为7.4～8.0。

3.6 金属离子及EDTA对胆碱酯酶活力的影响

金属离子对酶的活力有很大的影响。有些金属离子是稳定酶的三维构象的重要因素；有些金属离子则是直接参与催化反应的。外加的金属盐会改变酶的许多性质，金属离子对酶的活力影响也有很强的选择性，起抑制或激活作用。酶液游离的金属离子也会对胆碱脂酶的活力产生影响，溶液中加入的EDTA会吸收溶液中的游离金属离子，也会对酶活产生一定的影响。因此，本文研究了几种常见的金属离子及EDTA对胆碱酯酶活力的影响。

低浓度的Cu2+、EDTA对胆碱酯酶有明显的抑制作用，如C（Cu2+）=5 mmol/L时，可以抑制91%左右；C（EDTA）=10 mmol/L时，可以抑制20%左右；Ca2+、Mg2+、Mn2+则对胆碱酯酶有一定程度的激活作用，如C（Mg2+）=5 mmol/L时，可以激活27%左右；C（Ca2+）=5 mmol/L时，可以激活9%左右。

3.7 不同浓度的农药对胆碱酯酶活力的影响

胆碱酯酶是有机磷药剂的最适反应底物，其活性能够专一性地被有机磷和氨基甲酸酯类药剂所抑制。下面研究了在不同浓度农药对胆碱酯酶活性的影响。

如图1所示，农药对胆碱酯酶的抑制能力随着浓度的升高，抑制作用增强。其中，敌敌畏对胆碱酯酶的抑制作用灵敏度最高，其浓度在1 ppm后对胆碱酯酶的抑制率在90%以上；而其余农药在浓度大于10 ppm后对胆碱酯酶的抑制作用基本一致，对胆碱酯酶的抑制率在80%以上。

4 讨论

通过实验发现，胆碱酯酶对敌敌畏、敌百虫、氧化乐果、甲胺磷、乙酰甲胺磷的敏感性非常高，可用于对有农药残留的蔬菜进行检测。此外，该方法检测某些蔬菜品种如韭菜、萝卜、苦瓜时会出现假阳性结果，因为这些蔬菜含有还原剂，会影响靛酚乙酸酯的显色效果，所以这几种蔬菜不能用酶抑制法来检测。同时，该方法检测农药残留还有其他缺陷，如样品中含有过多的叶绿素、植物次生物质及反应过程中的时间、温度等均对检测结果有影响。而且，该方法只能检测对乙酰胆碱酯酶有抑制作用的有机磷及氨基甲酸酯类农药，对其他类型农药造成的污染则无法检出。

参 考 文 献

[1]姚建仁，郑永权，董丰收.浅谈农药残留污染、中毒与控制策略[J].植物保护，2001，27（3）：31-35.

[2]王晶，陈义珍，张田，等.三种农药残留量速测方法的对比性试验研究[J].中国食品卫生杂志，2001，13（6）：

18-20.

[3]丁诗华，李清漪.赤子爱胜蚓胆碱酯酶的纯化和性质[J].

应用与环境生物学报，1997，3（3）：246-251.

[责任编辑：陈泽琦]