罗汉果祛痰作用谱效关系研究

王勤 肖喜泉 董威 唐慧勤 卢凤来 李耀华 李典鹏 王剑 林吴

摘要： 为了研究罗汉果祛痰作用与活性成分的相关性，该研究首先测定了19批罗汉果提取物高效液相（HPLC）指纹图谱和小鼠气管酚红排泌量，找出了指纹图谱共有峰，采用灰色关联度法确定各共有峰对祛痰效果贡献度，利用偏最小二乘法（PLS）得出了各共有峰的正负相关及贡献度。结果表明：共有峰为14个，其中关联度在0.8以上的有12个峰（正相关峰为3、11、12、13号峰，负相关峰为1、2、4-10、14号峰）；11、12号峰分别为氧化罗汉果苷Ⅴ和罗汉果苷Ⅴ。因此，罗汉果祛痰作用不是单一成分起作用，而是多种成分综合作用的结果。其中，氧化罗汉果苷Ⅴ和罗汉果苷Ⅴ有祛痰作用，贡献率较大。

关键词： 罗汉果， 祛痰作用， 谱效关系

中图分类号： Q946

文献标识码： A

文章编号： 10003142（2017）05060604

Abstract： In order to investigate the relationship between expectorant efficacy and active components of Siraitia grosvenorii， the phenol red secretion of trachea in mice and the HPLC fingerprint of S. grosvenorii extract were determined. Grey relational analysis was applied to confirm the contribution degree of each common peak from HPLC fingerprints for expectoration efficacy， while partial leastsquares regression （PLS） was utilized to confirm either positive or negative relationship， and to identify the contribution degree of S. grosvenorii extract. The results indicated that fourteen common peaks were chosen in HPLC fingerprints， including twelve peaks with relation rate higher than 0.8 （No.3， 11， 12， 13 peaks were positive correlation peaks， and No.1， 2， 4-10， 14 peaks were negative correlation peaks）， No.11 and 12 peaks were Oxomogroside V and Mogroside V respectively. Therefore， expectorant efficacy of S. grosvenorii is contributed by a combined action of multicomponents rather than one component. Oxomogroside V and Mogroside V have an expectorant efficacy and high contribution degree.

Key words： Siraitia grosvenorii， expectorant efficacy， spectrumefficacy relationship

羅汉果（ Siraitia grosvenorii） 是广西道地中药材，具有止咳、祛痰、通便、解痉、保肝（王勤等，1999； 张宏等，2011）、抗病毒、抗肿瘤、抗疲劳（夏星等，2012； 何超文等，2012b） 等广泛的药理活性。而与药理作用相关的活性成分大多指向罗汉果甜苷Ⅴ（王霆等，1999；刘婷等，2007），其他化学成分对药理作用是否有贡献，尚不明确。

2015年版《中华人民共和国药典》中罗汉果的评价标准有定性鉴别及规定罗汉果皂苷Ⅴ的含量测定不得少于0.50%（国家药典委员会，2015）。现行的罗汉果质量标准对保障罗汉果的基本质量起了肯定的作用，但它忽略了中药的药效是多成分的协同作用，难以对其质量进行较全面的评价。而中药谱效关系是将中药的药效与指纹图谱很好地结合起来评价中药内在质量及其成分与其活性间关系的新方法（国家中医药管理局中华本草编委会，1999）。本研究通过建立罗汉果指纹图谱获得化学数据，同时采用小鼠酚红排泌法获得祛痰药效数据，运用灰度关联法与最小偏二乘法将化学数据与药效数据相关联，建立罗汉果祛痰的谱效关系模型。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材与试剂罗汉果药材19批，均为青皮果，经广西中医药大学药物鉴定教研室田慧教授鉴定为罗汉果（Momordica grosvenori）的果实。药材编号及产地：永福龙江（S1-11，育苗方式、采摘时间、果形大小等有差异，下同）、湖南衡阳（S12-13）、南宁坛洛（S14-15）、永福堡里（S16-17）、永福百寿（S18-19）。对照品罗汉果苷Ⅴ为本实验小组自制，远志购自柳州市神农中药饮片厂，批号20130305。酚红，国药集团化学试剂有限公司，批号20130725。碳酸氢钠，成都市科龙化工试剂厂，批号：20130409。氢氧化钠，成都市科龙化工试剂厂，批号：2013102101。分析纯甲醇、乙醇、磷酸，广东汕头市西陇化工厂。色谱纯乙腈，美国TEDIA公司。水为重蒸蒸馏水，自制。

1.1.2 仪器1100分析型高效液相色谱仪（包括二极管列阵多波长DVD检测器、四元梯度泵、在线真空脱气机、7725i手动进样器、HP化学工作站），美国Agilent公司；B3500SMT超声波清洗器，必能信超声（上海）有限公司；双光束紫外可见光光度计TU1901，北京普析通用仪器有限公司；L600台式低速自动平衡离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；MATLAB R2013数学软件，美国MathWorks公司。

1.1.3 动物昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～24 g，广西医科大学实验动物中心提供。合格证号： SCXK桂2009-0002。

1.2 方法

1.2.1 罗汉果提取物制备称取罗汉果药材1 000 g，先后用10倍量、8倍量、5倍量的水提取，时间分别为1.5、1、1 h，合并滤液，加热浓缩至1 000 mL，加入1倍量的95%乙醇，混匀，封口，-4 ℃静置48 h，抽滤，得滤液回收乙醇浓缩成浸膏备用。

1.2.2 小鼠气管酚红法420只小鼠，雌雄各半，随机分为19个罗汉果组、空白组与阳性远志组，每组20只。Ig分别给予罗汉果提取物每公斤40 g生药量（每公斤体重给罗汉果药材量），纯净水与远志提取物20 g·kg1（每公斤体重给远志药材量），给药体积为0.2 mL·10 g1，每天给药1次，连续给药3 d。第2天给药后禁食不禁水10 h。末次给药45 min后腹腔注射0.5%酚红溶液0.5 mL，15 min后闷死，用5% NaHCO3溶液1 mL灌洗呼吸道，重复3次，合并洗出液，离心，取上清液用紫外分光光度计（波长546 nm）比色。通过酚红溶液浓度标准曲线，计算酚红排泌量以及祛痰率。

祛痰率=（实验组平均酚红排泌量-空白组酚红排泌量）/ 空白组酚红排泌量

表1结果显示，远志组和19个罗汉果组对小鼠均有一定的祛痰作用。因此，对19批罗汉果提取物进行小鼠祛痰作用的谱效关系研究。

1.2.3 罗汉果提取物的HPLC指纹图谱

1.2.3.1 色谱条件色谱柱：ZORBAXSBC18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱温：20 ℃；流动相：0.05%磷酸（A）- 乙腈（B）（梯度洗脱：0～8 min，3%～13.5% B；8～35 min，13.5%～35%B；35～45 min：35% B）；检测时间：45 min；流速：0.8 mL·min1；檢测波长：203 nm；进样量：10 μL（卢风来等，2010）。

1.2.3.2 对照品溶液制备称取罗汉果苷Ⅴ、氧化罗汉果苷Ⅴ适量，用甲醇溶解到5 mL的容量瓶中，超声使其充分溶解，并用甲醇定容至刻度，以0.45 μm的微孔滤膜滤过，滤液作为对照品溶液。

1.2.3.3 供试品溶液制备取罗汉果浸膏2 g，精密称量，置25 mL容量瓶中，加入纯净水定容至刻度，溶解，摇匀，以0.45 μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。

1.2.3.4 HPLC图谱峰的归属精密吸取罗汉果苷Ⅴ及氧化罗汉果苷Ⅴ对照品溶液以及19批罗汉果供试药品溶液进样，按“2.3.1”项下色谱条件测定。19批罗汉果共确定有14个共有峰，其中11号和12号峰分别与对照品氧化罗汉果苷Ⅴ和罗汉果苷Ⅴ的保留时间与紫外光谱图相同，鉴定为氧化罗汉果苷Ⅴ和罗汉果苷Ⅴ（图1）。

2结果与分析

2.1 谱效关系的灰色关联度和关联顺序分析

将各共有峰原始数据进行标准化转换（即首先分别求出各个序列数据的平均值，再用平均值去除以对应序列中的各个原始数据，所得到的商为新的数据列，即均值化数列，又叫规格化数据）。根据灰色关联度分析法计算关联度，结果见表2。

从表2可以看出，各个共有峰所代表的化学成分与祛痰作用均具有一定的关联（关联度>0.60），表明罗汉果提取物的祛痰作用是其多个化学成分共同作用的结果。在罗汉果提取物HPLC指纹图谱中，1-4号峰、6号峰以及8-14号峰所代表的化学成分与祛痰作用具有高度关联（关联度>0.80）。依据关联度的大小，确定各成分（P）对祛痰作用贡献大小顺序为P11>P12>P1>P14>P8>P3>P13>P9>P6>P2>P4>P10>P7>P5。其中11号峰为氧化罗汉果苷Ⅴ，12号峰为罗汉果苷Ⅴ。

2.2 谱效关系的偏最小二乘法分析

使用MATLAB R2013软件，依据偏最小二乘分析方法，计算出上述指纹图谱中各个共有峰的峰面积与祛痰药效间的数理关系。表2结果表明，根据19批罗汉果提取物的图谱数据，得出各峰（P）对祛痰作用的贡献大小依次为P12>P11>P13>P3>P4>P10>P8>P7>P1>P2>P9>P14>P5>P6，其中P12、P11、P13、P3与祛痰效果呈正相关，P4、P10、P8、P7、P1、P2、P9、P14、P5、P6与祛痰效果呈负相关。

3讨论与结论

本研究使用经典的酚红排泌法来测定不同产地、不同采收期、不同加工方法的罗汉果共19批次的祛痰作用，结果罗汉果的祛痰作用明显。同时使用HPLC建立了罗汉果提取物的指纹图谱，发现了其中14个共有特征峰，并确定了其中2个指纹峰，分别为罗汉果苷Ⅴ与氧化罗汉果苷Ⅴ。用灰色关联度法进行谱效关系分析，结果表明在HPLC指纹图谱中，P11、P12、P1、P14、P8与祛痰作用的关联度较大，其中P11为氧化罗汉果苷Ⅴ，P12为罗汉果苷Ⅴ。王霆等（1999）报道罗汉果甜苷有祛痰作用，刘婷等（2007）也报道罗汉果皂苷Ⅴ有祛痰作用。本研究使用偏最小二乘法分析谱效关系，结果表明P12、P11、P13与祛痰作用呈正相关且贡献较大，P1、P14、P8则呈负相关，提示罗汉果提取物的祛痰作用可能是多种成分共同作用的结果，这与我们的预期相符。而罗汉果苷Ⅴ是罗汉果甜苷主要组成成分之一，本研究结果提示罗汉果苷Ⅴ对祛痰作用的贡献率较大，与王霆等（1999）和刘婷等（2007）的研究结果相吻合。

本研究中，由于通过质谱技术和对照品等因素，除了P11和P12外，其他峰是何化学成分还无法鉴定。而将这些化合成分分离出来，采用波谱技术进行鉴定，并测定其药理活性，将是本课题今后的研究方向之一。

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