马氏珠母贝细胞内视黄酸结合蛋白表达及其与类胡萝卜素的相关性分析

雷超 郑哲 李俊辉 王庆恒 黄荣莲 邓岳文

摘要：【目的】明確细胞内视黄酸结合蛋白（CRABP）对马氏珠母贝吸收代谢类胡萝卜素的影响，为培育富含类胡萝卜素的马氏珠母贝养殖新品系打下基础。【方法】采用RACE克隆马氏珠母贝CRABP基因（PmCRABP）cDNA全长序列，并以实时荧光定量PCR检测分析PmCRABP基因在各组织中的表达特征及其在黄白闭壳肌中的表达量。【结果】PmCRABP基因cDNA全长1778 bp，开放阅读框（ORF）长366 bp，编码121个氨基酸，其5'非翻译区（5'UTR）长125 bp，3'UTR长1287 bp。PmCRABP的分子量13.51 kD，理论等电点（pI）5.68，脂溶性系数62.81，不稳定指数35.38，总平均亲水性-0.517，其第5～120个氨基酸为Lipocalin家族的结构域。PmCRABP氨基酸序列与新对虾（Metapenaeus ensis）CRABP氨基酸序列的相似度最高，同属于CRABP蛋白，且二者的空间结构极其相似。PmCRABP基因在马氏珠母贝肝胰腺中的表达量最高，其后依次是外套膜、鳃和闭壳肌，各组织的表达量差异显著（P<0.05，下同）。黄白闭壳肌个体的类胡萝卜素含量与PmCRABP基因相对表达量存在显著差异，且二者间呈明显的正相关。【结论】PmCRABP参与了马氏珠母贝的类胡萝卜素代谢。

关键词： 马氏珠母贝；细胞内视黄酸结合蛋白（CRABP）；类胡萝卜素；克隆；表达

中图分类号： S968.316.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）06-1086-07

Abstract：【Objective】Effects of intracellular retinoic acid-binding protein（CRABP） on absorption and metabolism of carotenoid in Pinctada fucata martensii were investigated to lay a foundation for breeding carotenoid-rich strains. 【Method】In this study， cDNA full length sequence of PmCRABP was obtained using RACE technology. Expression cha-

racters of PmCRABP gene in different tissues and its expression in white and yellow colored adductor muscle were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The full length of PmCRABP gene was 1778 bp， including 366 bp of open reading frame（ORF）， encoded 121 amino acids， a 5'untranslated region（5'UTR） of 125 bp and a 3'UTR of 1287 bp. The molecular weight was 13.51 kD， theoretical isoelectric point（pI） was 5.68， aliphatic index was 62.81 ，instability index was 35.38 and the grand average of hydropathicity（GRAVY） was -0.517. The 5th to the 120th amino acids of the PmCRABP protein were the domains of Lipocalin family. Comparative analysis between amino acid sequence of PmCRABP and that of CRABP of other species indicated that， the similarity between PmCRABP and Metapenaeus ensis CRABP was the highest. Expression of PmCRABP gene in hepatopancreas of P. fucata martensii was the highest， and followed by mantle， gill and adductor muscle. There was significant difference between expressions in different tissues（P<0.05，the same beow）. Carotenoid contents and PmCRABP gene expression in yellow and white adductor muscles were significantly different， and there was a significant positive correlation between carotenoid content and PmCRABP expression. 【Conclusion】The results showed that PmCRABP gene is involved in carotenoid metabolism of P. fucata martensii.

Key words： Pinctada fucata martensii； intracellular retinoic acid-binding protein（CRABP）； carotenoid； cloning； expression

0 引言

【研究意义】马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）是我国广东、广西和海南地区的重要经济养殖贝类，主要用于生产有核珍珠（王大鹏等，2011）。除了生产海水珍珠外，马氏珠母贝还是一种营养价值较高的贝类，富含牛磺酸、无机盐及微量元素等营养物质，其贝肉中的糖胺聚糖成分具有抑瘤、抗凝血等功效（郝瑞娟等，2015；陈雪欣等，2016），牛磺酸具有抗疲劳、抑制血小板凝集、降血压血脂、降低胆固醇、保护视力及促进大脑发育等生理功能（孔晓荣，1993）。因此，培育富含营养成分的马氏珠母贝养殖新品系，是促进马氏珠母贝养殖业持续发展的新路径。【前人研究进展】视黄酸（Retinoic acid，RA）是维生素A的活性衍生物，属于一种低分子量的脂溶性信号分子（Balling，1991）。RA对脊椎动物的正常发育、组织细胞增生等起重要作用（黄蓓，1994；Sharma et al.，2003）。如RA会影响斑马鱼胚胎心脏房室分化（张立凤等，2007），是受孕期间及整个妊娠过程中决定胚胎是否能良好发育的一个重要因素（李艳敏等，2014）。RA含有共轭双键，极易被氧化剂氧化，必须在体内与细胞视黄酸结合蛋白（Cellular retinoic acid-binding protein，CRABP）结合以维持其稳定性（齐焰和谢院生，2015），即CRABP参与RA代谢。依据蛋白质结构分类数据库分类，CRABP属于脂质运载蛋白超家族成员，该蛋白家族成员均包含6或8个β桶，作为三级结构和高度保守结构域的一部分（Zhang et al.，2012），其主要功能是运载类固醇、类胡萝卜素、类维生素A及其他小疏水性分子（Yang et al.，2011）。CRABP可分为CRABP1和CRABP2，其中，CRABP1能增强P450氧化酶而抑制RA在细胞中的功能作用，CRABP2则是将RA从细胞质携带进入细胞核的关键因子（杨芳，2011；李华等，2012）。目前，有关CRABP的研究主要集中在脊椎动物上，Lee等（2006）对猪的CRABP1基因进行了定位，杨艳萍等（2013）研究了小鼠胚胎CRABP1阳性神经嵴细胞的时空分布与功能。【本研究切入点】明确CRABP在贝类胡萝卜素代谢中的作用，可为培育富含类胡萝卜素的贝类新品系打下基础，但至今有关CRABP在贝类上的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】采用RACE克隆马氏珠母贝CRABP基因（PmCRABP）的cDNA全长序列，分析PmCRABP基因在各组织中的表达特征及其在黄白闭壳肌中的表达量，明确PmCRABP对马氏珠母贝吸收代谢类胡萝卜素的影响，为培育富含类胡萝卜素的养殖新品系打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试马氏珠母贝来源于基础群体，均为2龄贝，养殖在广东湛江市徐闻县大井村海区，选取规格较一致（38.01±4.13 g）的个体进行试验。剪取其外套膜、肝胰腺、闭壳肌和鳃用于基因克隆与组织定量表达分析；同时选取黄色与白色闭壳肌个体，取闭壳肌用于类胡萝卜素含量与基因表达量分析。采集的样品均置于-80 ℃冰箱保存备用。总RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司，pMD19-T载体、DNA Marker、LA Taq DNA聚合酶、反转录试剂盒等购自宝生物工程（大连）有限公司，实时荧光定量PCR试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司，RACE试剂盒购自Clontech公司。

1. 2 PmCRABP基因全长cDNA克隆及序列分析

1. 2. 1 总RNA提取及第一链cDNA合成 采用Trizol提取不同组织和黄白闭壳肌的总RNA，以10 mg/mL琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性、SimpliNano核酸蛋白定量仪检测RNA浓度及纯度。参照反转录试剂盒说明合成中间片段cDNA模板，5'RACE和3'RACE模板的制备参照RACE试剂盒说明。

1. 2. 2 引物设计与合成 从本课题组已建立的转录组数据库中筛选出与PmCRABP基因相似度较高的unigene片段，并以Primer Premier 5.0设计特异性引物（表1）。

1. 2. 3 PmCRABP基因片段克隆 PCR反应体系及扩增程序参照LA Taq DNA聚合酶说明进行操作，获得的PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测为目的条带后，纯化并连接至pMD19-T载体，再转化感受态细胞DH5α，菌液培养1 h后涂布于含Amp+的固体培养基上37 ℃倒置培养12 h，挑取阳性克隆进行PCR检测，并将目的基因送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。同时，采用巢式PCR对PmCRABP基因的3'端和5'端进行RACE扩增。

1. 2. 4 序列分析 利用DNAMAN将测序片段进行拼接，以获得PmCRABP基因cDNA全長。同时，采用NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中的BLAST程序进行序列同源性比对和相似性分析，采用ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）对PmCRABP基因进行开放阅读框（ORF）和蛋白序列预测，采用DNAMAN中的Phylogenetic tree构建基于CRABP的系统发育进化树，采用MUSCLE（http：//

www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）对PmCRABP氨基酸序列与其他物种CRABP氨基酸序列进行同源性比对分析，使用SMART程序预测分析PmCRABP蛋白结构域，分别以ExPASy（http：//web. expasy.org/ vg/index/

protein）和SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/

Signal/）对其氨基酸序列的理化性质进行分析和信号肽预测，采用TMHMM Server v.2.0预测PmCRABP蛋白的跨膜结构域，采用Motif Scan（http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）对PmCRABP蛋白进行功能位点检测，并以SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.

fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）预测PmCRABP蛋白的二级结构、SWISS-MODEL（http：//

swissmodel.expasy.org/）预测PmCRABP蛋白的三级结构。

1. 3 黄白闭壳肌类胡萝卜素的提取与测定

参考吴小芬等（2016）的方法进行黄白闭壳肌类胡萝卜素含量测定分析，即分别准确称量黄白闭壳肌0.1 g，加入等量无水硫酸钠和5 mL丙酮（分析纯）充分匀浆，另加入5 mL丙酮润洗匀浆器2次，然后一并转入10 mL的具塞试管中，用锡纸避光密封，4 ℃下保存3 d后4000 r/min离心10 min，取上清液，以紫外分光光度计在480 nm 處测定吸光值。

总类胡萝卜素含量（μg/g）= A×K×V/E×G

式中，A为吸光值，K为常数（104），V为提取液体积（mL），E为摩尔消光系数（2500），G为样品质量（g）。

1. 4 不同组织中的PmCRABP基因差异表达

采用实时荧光定量PCR分别检测马氏珠母贝鳃、外套膜、闭壳肌、肝胰腺和黄白闭壳肌的PmCRABP基因表达情况，通过2-ΔΔCt计算其相对表达量，并以SPSS 19.0进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2. 1 PmCRABP基因的克隆与序列分析结果

通过RACE扩增分别获得PmCRABP基因的5'非翻译区（5'UTR）和3'UTR，其中，5'UTR长125 bp，3'UTR长1287 bp。利用DNAMAN将测序片段进行拼接后，得到PmCRABP基因cDNA全长1778 bp，其开放阅读框（ORF）366 bp，编码121个氨基酸（图1）。

2. 2 PmCRABP的理化性质分析结果

经相关在线软件预测发现，PmCRABP的分子量13.51 kD，理论等电点（pI）5.68，脂溶性系数62.81，不稳定指数35.38，属于稳定蛋白（图2）；总平均亲水性-0.517，属于疏水性蛋白。SignalP4.1预测结果显示，PmCRABP不含信号肽，属于非分泌蛋白。经SMART分析得知，PmCRABP的第5～120个氨基酸为Lipocalin家族结构域。PmCRABP功能位点检测结果发现，该蛋白有1个cAMP和cGMP依赖性的蛋白激酶磷酸化位点、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个N-豆蔻酰化位点、3个蛋白激酶C磷酸化位点和1个胞质脂肪酸结合蛋白信号位点。

2. 3 PmCRABP与其他物种的同源性比对分析结果

利用DNAMAN中的Phylogenetic tree对不同物种的视黄醇类蛋白（表1）进行聚类分析，结果显示，CRABP蛋白、CRBP蛋白和RBP蛋白各自分开形成一簇（图3）。其中，马氏珠母贝与新对虾聚在同一亚支上，同属于CRABP蛋白，说明它们起源于同一祖先的基因复制。

采用MUSCLE对小家鼠（M. domesticus，CAA-

36011.1）、新对虾（M. ensis，AAL68638.1）、烟草天蛾（M. sexta，AAC24317.1）、家蚕（B. mori，NP_0010373-

64.1）和PmCRABP氨基酸序列进行同源比对分析，结果（图4）表明，PmCRABP与小家鼠、烟草天蛾和家蚕的CRABP氨基酸序列同源性不高，但与新对虾的同源性较高。

SOPMA二级结构预测结果表明，PmCRABP的α螺旋占22.31%、β转角占14.88%、无规则卷曲占30.58%、延伸链占32.23%。利用SWISS-MODEL对PmCRABP和新对虾CRABP蛋白进行三级结构预测，结果发现二者的空间结构极其相似（图5）。以TMHMM Server v.2.0预测PmCRABP的跨膜结构域，结果显示PmCRABP无跨膜结构，即符合PmCRABP为胞内蛋白的特点。

2. 4 黄白闭壳肌个体的总类胡萝卜素含量及PmCRABP基因表达量

采用丙酮萃取法对马氏珠母贝的黄白闭壳肌进行总类胡萝卜素提取，并以实时荧光定量PCR检测PmCRABP基因在黄白闭壳肌中的表达量。结果表明，黄色闭壳肌中的总类胡萝卜素含量（图6）及PmCRABP基因表达量（图7）均显著高于白色闭壳肌（P<0.05，下同），且总类胡萝卜素含量与PmCRABP基因表达量呈明显的正相关。

2. 5 Pm-CRABP基因的组织表达差异分析结果

以实时荧光定量PCR检测马氏珠母贝鳃部、外套膜、闭壳肌、肝胰脏PmCRABP基因的相对表达量，结果表明，PmCRABP基因在以上组织均有表达，且在肝胰脏的相对表达量显著高于其他组织（图8）。

3 讨论

本研究利用RACE克隆获得PmCRABP基因序列，其cDNA全长1778 bp，共编码121个氨基酸。经NCBI中的BLAST分析，发现PmCRABP含有Lipocalin结构域，即属于Lipocalin超家族。PmCRABP是一种低分子量的细胞内结合蛋白，在体内负责结合视黄酸和其他相关脂肪酸（Gu et al.，2002）。经相关在线软件预测发现，PmCRABP的分子量13.51 kD，符合该类蛋白分子量低的特点。在动物体内，RA是维生素A最终的活性代谢产物（齐焰和谢院生，2015），而维生素A是一种动物机体必需的脂溶性维生素，机体无法自行合成而必须从食物中获取，其主要来源为植物中的类胡萝卜素和动物中的视黄酯（李艳敏等，2014）。自然界中存在600多种类胡萝卜素，其中约50种具有活性，以β-胡萝卜素活性最高（王二玲，2009）。被动物摄取的β-胡萝卜素在肠道内经β-胡萝卜素-15，15'-加氧酶（βCMOOX）氧化生成2个分子的视黄醇（维生素A），接着被吸收入体内氧化成视黄醛，再进一步被氧化成RA（Mezaki et al.，2012）。王二玲（2009）研究发现，全反式视黄酸能显著降低肉仔鸡十二指肠、空肠和肾脏内的βCMOOX活性，且抑制作用与其浓度（0～4 μmol/L）呈正比。由此推测，在马氏珠母贝体内PmCRABP是通过结合RA来参与类胡萝卜素代谢。

RA的生物转化过程在CRABP、视黄醇结合蛋白（RBR）和细胞内视黄醇结合蛋白（CRBP）的协助下依次在小肠、肝脏和目标细胞中完成（Das et al.，2014）。为比较PmCRABP基因在马氏珠母贝不同组织中的表达量，本研究采用实时荧光定量PCR对马氏珠母贝闭壳肌、鳃、肝胰脏和外套膜4个组织中的PmCRABP基因进行检测，结果显示在肝胰腺的相对表达量最高，但具体转运机制有待进一步探究。CRABP作为结合RA的特定蛋白，主要存在于RA含量较高的组织中（Balling，1991），而RA对β-胡萝卜素又有反馈调控作用（王二玲，2009）。本研究也发现，基础群体黄白闭壳肌个体的总类胡萝卜素含量存在显著差异，对应的PmCRABP基因表达量也存在显著差异，且总类胡萝卜素含量与PmCRABP基因表达量呈明显的正相关，进一步说明PmCRABP是通过结合RA来参与类胡萝卜素代谢。

4 结论

马氏珠母贝黄白闭壳肌个体的总类胡萝卜素含量和PmCRABP基因相对表达量均存在显著差异，且二者间呈明显的正相关，说明PmCRABP参与了马氏珠母贝的类胡萝卜素代谢。

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（責任编辑 兰宗宝）