高效液相色谱—串联质谱同时分析猪肉中四环素类和喹诺酮类抗生素残留

甘沛明 邓晓华 招钰娟 梁雪琪 黎小鹏

摘要 [目的]建立猪肉中喹诺酮类和四环素类抗生素的同时分析方法。[方法]样品经过与HLB固相萃取小柱净化、洗脱，以高效液相色谱-串联质谱仪使用多反应监测（MRM）离子模式进行定性、定量分析。[结果]以猪肉为基质，四环素类抗生素在加标浓度为2和5 μg/kg时，回收率为75.7%～88.7%，相对标准偏差为1.2%～5.6%（n=3），方法检出限为0.4～1.5 ng/mL；喹诺酮类抗生素在加标浓度为2和5 μg/kg时，回收率为79.0%～90.5%，相对标准偏差为2.1%～6.3%（n=3），方法检出限为0.5～2.0 ng/mL。[结论]该试验所建立的方法可成功地应用于猪肉中目标抗生素残留的分析。

关键词 高效液相色谱-串联质谱；喹诺酮类；四环素类；抗生素

中图分类号 S851.34+7.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）06-0076-03

Simultaneous Determination of Quinolone and Tetracycline Antibiotics Residues in Pork by HPLC-MS/MS

GAN Pei-ming，DENG Xiao-hua，ZHAO Yu-juan et al （Zhongshan Quality Supervision & Inspection of Agricultural Products，Zhongshan，Guangdong 528400）

Abstract [Objective] To establish a method for simultaneous determination of quinolone and tetracycline antibiotics in pork.[Method] Using HLB cartridge for purification and elution，the qualitative and quantitative analysis was performed by HPLC-MS/MS MRM ion model.[Result] Using pork as substrate，the recoveries and relative standard deviations （RSD，n=3） were 75.7%-88.7%，1.2%-5.6% for tetracycline at 2 and 5 μg/kg spiking levels and 79.0%-90.5%，2.1%-6.3% for quinolone at 2 and 5 μg/kg spiking levels，respectively.The detection limits were 0.4-1.5 ng/mL for tetracycline and 0.5-2.0 ng/mL for quinolone.[Conclusion] The method can be successfully applied to the survey of antibiotics in pork.

Key words HPLC-MS/MS；Quinolone；Tetracycline；Antibiotics

随着畜禽、水产养殖业的快速发展，我国抗生素的用量和种类也在日益增长。动物性产品中抗生素的残留不仅会引起食品安全问题，还会对环境带来影响。大多数抗生素不能被动物肠胃完全吸收，有50%～70%以母体或代谢物的形式排出动物体外[1]，对生态系统的健康产生毒害，并通过食物链最终对人体的健康產生危害[2-7]。目前，畜禽食品中残留抗生素对环境的污染和人类的危害已引起人们的高度重视。

为治疗动物疾病和提高动物抗病能力，喹诺酮类和四环素类药物被人们广泛地应用于动物饲养过程中，从而造成肉类中抗生素药物的残留。人类通过不同途径摄入后都会在体内蓄积，导致很多细菌产生了抗药性，对人类的身体健康有相当大的危害[8-10]。目前，食品安全监督机构以及相关企业将这2类药物均列为日常检测项目，进行重点监控。

因此，笔者选择常用的四环素类和喹诺酮类抗生素为研究对象，采用HLB固相萃取小柱进行净化，高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）技术检测，建立了动物性食品中高灵敏度的同时分析方法，并将所建立的方法应用于各种动物性食品的四环素类和喹诺酮类抗生素残留的检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器。1200-6410高效液相色谱串联质谱仪，配有电喷雾离子（ESI）源，美国Agilent公司；Milli Q 净化系统，默克公司；氮吹仪，杭州雪中炭公司；1/100 000天平，梅特勒托利多公司；1/10天平，赛多利斯公司；匀浆机，IKA公司；固相萃取装置，美国Agilent公司；冷冻离心机，希格玛公司。

1.1.2 主要试剂。四环素、金霉素、土霉素，氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星标准品，均购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，纯度均不低于90%；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸乙酯，默克公司；Plexa固相萃取柱（200 mg 6cc），美国Agilent公司；Mcllvaince-Na2EDTA缓冲液、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、氢氧化钠，分析纯，广州化学试剂厂。

1.2 标准品以及试剂配制

分别准确称取3种四环素类标准品各5.000 0 mg，以甲醇溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，混匀即得浓度为100 mg/L各标准物质储备液，-20 ℃保存备用。

分别准确称取4种喹诺酮类标准品各5.000 0 mg，以0.1%甲酸水+乙腈（1∶4）溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，混匀即得浓度为100 mg/L各标准物质储备液，4 ℃保存备用。

0.05 mol/L 磷酸二氢钠溶液：取磷酸二氢钠7.8 g，用水稀释至1 000 mL。

0.05 mol/L磷酸氢二钠溶液：取磷酸氢二钠17.9 g，用水稀释至1 000 mL。

磷酸盐缓冲溶液：取0.05 mol/L 磷酸二氢钠溶液190 mL，用0.05 mol/L磷酸氢二钠溶液稀释至1 000 mL。

Mcllvaince-Na2EDTA缓冲液：分别取柠檬酸12.9 g，磷酸氢二钠10.9 g，乙二胺四乙酸二钠39.2 g，用900 mL水稀释，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至5.0，误差小于0.2，用水稀释至1 000 mL。

洗脱液：取甲醇150 mL，加乙酸乙酯150 mL、浓氨水6 mL，混匀。

1.3 仪器分析条件

1.3.1 液相色谱条件。

色谱柱为Agilent Poroshell EC-C18（2.1×100 mm，2.7 μm）；流动相如表1所示；柱温45 ℃；流速为0.4 mL/min；进样量10 μL。

1.3.2 质谱条件。

电离方式为ESI+，检测模式为多反应监测（MRM），毛细管电压4 000 V，干燥气流量10 mL/min，干燥气温度350 ℃，雾化器压力2.76×105Pa，定性离子对、定量离子对及碰撞能量见表2。

1.4 样品前处理

1.4.1 提取。

准确称取试料5 g于50 mL离心管中，加入Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液8 mL，涡旋1 min后超声20 min，10 000 r/min、4 ℃ 离心5 min，取上清液到另一50 mL离心管中，残渣用磷酸盐缓冲溶液8 mL重复提取1次，合并上清液，混匀备用。

1.4.2 净化。HLB萃取柱依次用甲醇5 mL和水5 mL活化，取备用液过柱。依次用水5 mL、20%甲醇水溶液5 mL淋洗，抽干5 min用洗脱液10 mL洗脱，收集洗脱液，于45 ℃水浴氮气吹干，加入初始流动相1 mL涡旋1 min溶解残留物。0.22 μm滤膜过滤，供测定。

2 结果与分析

2.1 固相萃取柱的选择

选用HLB固相萃取小柱吸附是保证高效萃取效率的基础。该试验对比研究了C18萃取柱与HLB萃取柱对7种抗生素的富集效果。结果表明，HLB柱对7种抗生素具有较好的萃取效果，且重复性更好。因此确定HLB柱作为萃取柱。

2.2 工作曲线的线性范围和方法的检出限

在该试验条件下标准溶液的浓度在10、20、50、100、200、400 ng/mL各取10 μL进样，记录色谱图得出各种兽药线性方程、相关系数，以最低浓度混合标准品逐步稀释，进样并分析S/N=3确定检出限（LOD），结果见表3。

2.3 样品的加标回收率及相关系数

取猪肉基底，添加2和5 μg/kg，按“1.4”前处理方法对样品进行处理，每个质量浓度平行测定3份，考察方法的回收率以及重现性。在分析前添加至样品中，对分析过程进行质量控制。从表4可以看出，在各加标水平上，猪肉中兽药的加标回收率在75.7%～90.5%，相对标准偏差（RSD）在1.2%～6.3%。由此可见，所建立的方法有较好的重现性，回收率也完全符合要求。

3 结论

该研究采用SPE前处理法与LC-MS/MS联用技术同时分析猪肉中的四环素类和喹诺酮类抗生素残留。样品经过HLB固相萃取小柱净化、洗脱，建立了猪肉中四环素类和喹诺酮类抗生素同时分析的高灵敏多反应监测（MRM）离子模式进行定性、定量分析的方法。该方法以猪肉为基质做添加回收，猪肉中兽药的加标回收率在75.7%～90.5%，相对标准偏差（RSD）在1.2%～6.3%。结果显示，该前处理方法均符合国标要求。该试验所建立的多残留检测方法大大地提高了工作效率，降低了分析成本，对动物性食品的安全卫生工作意义重大。

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