RNAi 3种分子加工机制研究进展

肖稳 周玮

摘要 RNAi（RNA interference，RNA干扰）是一种高度保守的由小分子RNA介导的基因沉默过程。根据介导RNAi的小RNA长度以及结合Argonaute （AGO）蛋白家族成员的不同，将小RNA分为miRNA （microRNA ）、siRNA （small interfering RNA ）和piRNA （Piwi-interacting RNA ） 3类。根据近年来取得的研究进展，系统地阐述了这3类小RNA的基因组来源及其加工产生机制，归纳总结了这3类小RNA之间的区别和联系，并结合当前RNAi应用于疾病治疗存在的问题提出了自己的看法。RNAi机制的完善对于生物进化、生长发育及癌症等重大疑难疾病治疗具有重要的应用价值。

关键词 RNAi； miRNA；siRNA；piRNA

中图分类号 S188；Q78 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）06-0133-04

Research Progress of Processing Mechanisms of Three Molecules of RNAi

XIAO Wen，ZHOU Wei* （College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128）

Abstract RNAi is a highly conserved gene silencing process mediated by small RNA.Based on the differences of small RNA length and its combined Agonaute （AGO） family members，small RNA is divided into 3 categories：miRNA （microRNA），siRNA （small interfering RNA） and piRNA （Piwi-interacting RNA）.Accordingly the reviews，we systematically expound the three small RNA genomic origin and the mechanisms of their production and processing.Furthermore，we summarize the connections among these three small RNAs.Finally，the authors offer a view on problems hindered in RNAi applications on disease treatment of the humans.The perfection of RNAi mechanisms is important to biological revolution，growth and development and treatment of critical illnesses like cancer.

Key words RNAi；miRNA；siRNA；piRNA

自1998年Fire和Mello首次提出RNAi（RNA interference，RNA干扰）概念以来[1]，越来越多的人开始重视小RNA的研究，之后RNAi在基因功能的研究中也得到广泛应用。RNAi是一种存在于真核生物中的转录后基因沉默现象，在生物进化过程中能够抵御病毒感染及防止基因组中由于逆转座子元件扩增引起的不稳定。在miRNA （microRNA）、siRNA （small interfering RNA）及piRNA （Piwi-interacting RNA）等小RNA的介导下，RNAi能够特异性地调控mRNA基因在表观遗传学水平、转录水平及转录后水平的表达。笔者阐述了miRNA、siRNA、piRNA这3类小RNA的基因组来源及其加工产生机制研究现状，归纳和总结这3类小RNA之间的区别和联系，以期深入了解小RNA在生物进化、生长发育以及各种疾病治疗等方面的应用，进一步完善RNAi机制。

1 miRNA

1.1 miRNA简介

miRNA是一类长度约为22 nt，在大多数体细胞中都广泛存在的内源单链小RNA，由较长的含有茎环结构的前体加工而来。1993年Lee等[2]在秀丽隐杆线虫中发现的lin-4，是第1个被人们所确认的miRNA。2000年Reinhart等[3]又在线虫中发现了let-7，该miRNA在进化过程中非常保守，从而引起人们的重视，开启了一个全新的miRNA时代。之后在植物、动物、单细胞真核生物、病毒等多类物种中陆续发现了miRNA[4-8]。目前在miRBase中收录了223个物种的35 828个成熟miRNA，28 645个前体miRNA（version 21），其中人类成熟miRNA有2 588種，小鼠有1 982种。在miRNA介导的mRNA沉默过程中，miRNA与靶标mRNA碱基部分互补配对，而与之结合的Argonaute蛋白（AGO，AGO1～AGO4）通过招募脱腺苷酸化酶，导致靶标mRNA发生脱腺苷反应，进一步发生降解[9]，或者通过招募翻译抑制因子，引起该mRNA翻译抑制。miRNA与靶标mRNA的结合位点通常位于mRNA的3′UTR区[10]，但也有报道位于5′UTR区和编码区的情况[11-12]。

1.2 miRNA加工机制

大部分miRNA是由RNA聚合酶II从基因组上转录形成含有茎环结构的初始转录本（pri-miRNA），该转录本带有类似mRNA的5′端帽子和3′端polyA尾巴。细胞核内存在一种叫作“微处理器”的复合物（Microprocessor complex），包含核糖核酸酶III（RNaseIII）家族内切酶Drosha和辅助蛋白DGCR8（在哺乳动物中是DGCR8，在果蝇中是Pasha）。其中Drosha能够识别pri-miRNA位于茎环基部的基序5′-UG-3′，DGCR8能够识别pri-miRNA位于茎环顶部的基序5′-GUG-3′或5′-UGU-3′，因此“微处理器”能够识别pri-miRNA并准确在距离基底结（basal junction）约11 bp处剪切，将pri-miRNA加工成长度约为70 bp的前体miRNA（pre-miRNA），此外，存在于茎的第7～9位碱基处的“错配基序”-GHG（其中H指除了G之外的任意碱基）能够加快pre-miRNA的加工过程。另外，在两侧对称动物（bilaterian animals）中还发现一类位于基底结下游的基序CNNC，它能和辅助蛋白SRp20结合，同样能够有效地提高pri-miRNA的加工效率[13-16]。加工产生的pre-miRNA的3′端有2个碱基的悬垂，这种结构在Ran-GTP的介导下，被细胞核内的转运蛋白Exportin-5识别，将其转运到细胞质中。在细胞质中，pre-miRNA被另一种核酸内切酶Dicer及其辅助蛋白TRBP（The HIV transactivating response RNA-binding protein，在哺乳动物中是TRBP，在果蝇中是Loqs）切割并加工成大约22 bp的双链miRNA[17]，通常双链miRNA中5′末端碱基配对稳定性较差的那条链会被AGO蛋白结合，组装形成miRNA介导的沉默复合体[18]（RNA-induced silencing complex，RISC）。在动物中，成熟miRNA主要通过种子区域（即从miRNA的5′端起2～7 nt碱基处）识别靶标mRNA，并通过其他位置部分互补配对方式招募下游因子TNRC6和CCR4-NOT复合物促使mRNA降解或招募翻译抑制因子抑制mRNA的翻译，调控靶标基因的表达[10-19]。

pri-miRNA还存在一些特殊的加工方式。2007年，David P.Bartel实验室以及Eric C.Lai实验室分别在果蝇中发现了miRNA成熟的另一种途径[20-21]。他们发现有些内含子在被剪接复合体切下来后会具有pre-miRNA的结构特征，使其直接被Dicer加工成为双链miRNA而不需要Drosha介导的切割，这类来源于内含子的miRNA被称为“mirtron”。2010年，有3个实验室分别在斑马鱼、小鼠以及人类细胞中发现miR-451这个高度保守的miRNA的发生不依赖于Dicer的切割，而是pri-miR-451在核内被Drosha/DGCR8复合物加工后产生pre-miR-451（其双链区相对于普通的pre-miRNA要短，只有18 bp），后者出核后直接被AGO2蛋白在一个特异的位点切割并进一步被细胞内的PARN蛋白剪切[22]，生成大约23个核苷酸的成熟miR-451[23-25]。

此外，miRNA在动物体内广泛存在成簇的现象，多个成熟的miRNA由同一个miRNA初始转录本加工合成，且这些来自相同基因簇的miRNA多具有较强的同源性[26]。另外，单一miRNA基因座可以通过miRNA加工成熟过程产生一系列亚型miRNA，称为isomiR，它们在长度、在pre-miRNA上的5′端起始位置以及3′端终止位置存在差异[27]。生物体通过多样化的加工方式，使得miRNA的产生形成一个复杂的调控网络，以适应越来越复杂的生物多样性及环境多样性。

2 piRNA

2.1 piRNA简介 piRNA是一类与Argonaute家族的PIWI亚家族蛋白特异结合的长度为25～32 nt的内源性小RNA，5′端多具有1 U偏好性，具有组织特异性，多存在于动物生殖细胞中，在成年期小鼠的大脑中也发现了piRNA[28]。果蝇PIWI家族成员有Piwi、AGO3、Aub；小鼠PIWI家族成员包括Miwi、Mili、Miwi2；而人类PIWI家族含有4个成员，分别命名为Hili、Hiwi、Hiwi2、Hiwi3。2001年Aravin等[29]在果蝇Y染色体上发现由Stallate同源的假基因Su（Ste）编码的一类小RNA，就是现在的piRNA，能够和PIWI家族的Aub相互作用。2006年Girard、Aravin、Grivna、Lau等所在的实验室几乎同时在人、小鼠、大鼠、果蝇等生物的生殖细胞中发现了piRNA[30-33]。迄今为止，piRNA种类是非编码小RNA中最多的，piRBase中收录的piRNA超过7 700万种（version 1.0），其中黑腹果蝇达21 027 419种，并且它的piRNA超过80%来源于转座子；小鼠piRNA达51 664 769种，主要是粗线期piRNA，这些piRNAs约93%来源于基因组单个位点[34]。piRNA在沉默转座子、调控编码基因、调节生育能力等方面发挥重要功能。

2.2 piRNA加工机制

piRNA序列主要来源于基因组上的基因编码区、转座子以及基因间隙等，且成簇分布，这些区域被称为piRNA簇[35]。piRNA簇是由长的单链转录本加工而来，根据初始转录本方向又可分为单向piRNA簇和双向piRNA簇。单向piRNA簇是具有单一方向转录本加工产生的簇；双向piRNA簇是由两端转录形成2条互补的转录本加工产生[35]。在果蝇卵泡细胞中（Follicular Cells），piRNA只有初级加工途径，并在Yb小体中进行。Yb小体是胞浆中一种靠近细胞核的无膜细胞器，它包含Yb蛋白、Tudor结构域蛋白Vreteno （Vret）、SDE结构域蛋白Armitage （Armi）、FKBP家族蛋白shu等多种组分。这些初始转录产物被转运到胞浆后，经Yb小体加工[36-39]，然后被线粒体外膜上的核酸外切酶Zuc及其辅助因子切割形成5′端成熟的piRNA前体[40-41]，该前体可与Piwi蛋白结合，再由Trimmer蛋白以及辅助因子papi去掉3′端多余的碱基形成成熟的piRNA，最后Hen1作用于piRNA 3′端，使其形成2-O-甲基化，形成成熟的初级piRNA[42-43]。

在生殖细胞中，piRNA的形成包括初级加工途径和次级加工途径。以果蝇为例，初级加工途径与卵泡细胞中类似，首先转录产物转运出核，由于生殖细胞没有Yb小体和Yb蛋白，所以由1个与Yb小体类似的细胞器nuage代替，nuage存在2个Yb家族的蛋白，Brother of Yb （BoYb）和Sister of Yb （SoYb），取代Yb蛋白参与piRNA的初级加工[44]。初级piRNA的成熟可能有2种途径：一种是在Spindle-E的协助下转录本结合Aub蛋白，再由Trimmer蛋白以及輔助因子papi剪切3′端多余的碱基形成成熟长度的piRNA，最后Hen1甲基化piRNA 3′端，形成成熟的初级piRNA；另一种是Aub蛋白结合转录本之后，Piwi蛋白结合在3′端，然后由Zuc剪切成两段，两者3′端分别被Hen1甲基化后形成2种初级piRNA：Aub-piRNA和Piwi-piRNA [43，45]。目前对生殖细胞中piRNA初级加工的具体途径研究尚未明了。

结合Aub蛋白的初级piRNA进入次级加工途径，Aub-piRNA通过碱基互补配对结合到反转座子RNA上，靶标RNA被具有Slicer活性的Aub剪切，其3′端产物在Vasa的协助下与AGO3结合[46-47]，通过Zuc或者trimmer剪切，再由Hen1甲基化形成AGO3结合的成熟piRNA，AGO3-piRNA又识别、结合、剪切与之互补配对的piRNA簇，其3′端产物加工成新的Aub-piRNA，Aub-piRNA进入新一轮的循环产生新的AGO3-piRNA。此途径既沉默了反转座子，又形成了大量的次级piRNAs，这就是著名的“乒乓循环”模型（ping-pang model）。

“乒乓循环”模型产生的piRNA普遍有以下特点：Aub 主要与反义链piRNA结合，第1个碱基一般是 U，所以大部分piRNA的5′端有1U偏好性；而 AGO3 结合正义链piRNA，且与Aub结合的反义piRNA的5′端有10个碱基的互补配对，所以这部分piRNA第10个碱基有A偏好性[48]。

在哺乳动物中，piRNA的合成加工更加复杂。在小鼠精子发生过程中，piRNA主要分为3类：①主要来自基因组重复序列的出生前piRNA（prenatal piRNA），这部分piRNA能够与Miwi2、Mili这2种蛋白结合，长度为26～28 nt。Mili蛋白出现在12.5 dpc（day post coitum），主要分布在细胞质中， Miwi2蛋白出现在14.5～15.5 dpc，主要分布在细胞核内。 Mili-piRNAs能自身发生“乒乓循环”，产生的piRNAs可以传递给Miwi2，Miwi2携带这部分piRNAs入核，招募DNMT3L进行甲基化从而在转录水平抑制转座子；②来源于编码基因的3′UTR区域的mRNA衍生piRNA（mRNA-derived piRNA），出生后的piRNA和大多数前粗线期piRNA是mRNA-derived piRNA，这类piRNA也是与Miwi2、MIli这2种蛋白结合，长度为26～28 nt，但其功能还是未知的；③来源于长非编码转录本的粗线期piRNA，长度为29～31 nt，这部分piRNA的初始转录本在A-MYB的协助下从基因间隙转录，其加工过程也需要Tudor蛋白、Armi蛋白、核酸外切酶Zuc的参与。这类piRNA主要结合的Miwi蛋白出现在12.5 dpp （days post partum）之后。有报道称Miwi-piRNA与脱腺苷酸酶CAF1形成的pi-RISC复合物通过与靶mRNA不完全互补配对，诱导靶mRNA脱腺苷酸而降解[49-50]。

3 siRNA

3.1 siRNA简介

siRNA是一类经RNase III核酶家族的Dicer剪切后生成的长度约为21 bp的单链小RNA分子，特异性的与AGO蛋白家族中的AGO2结合，并利用AGO2的切割活性，介导靶标mRNA切割，并导致靶标mRNA的最终降解。Dicer加工过程中，形成19 bp碱基互补配对区，3′端有2个碱基悬垂的双链siRNA前体。siRNA双链中能够与目标mRNA完全互补配对的那条链称为向导链（guide stand），另一条则称为passenger 链（passenger strand）。siRNA分子根据来源不同，分为外源性siRNA（exo-siRNA）和内源性siRNA（endo-siRNA）：体外人为导入形成的siRNA称为外源性siRNA，细胞内转录加工产生的siRNA称为内源性siRNA。1998年， Fire等[1]用秀丽隐杆线虫进行反义RNA抑制试验时发现，对照组中加入的双链RNA（double-stand RNA，dsRNA）相比正义或反义RNA显示更强的基因表达抑制，并首次将这种现象命名为RNA干扰。siRNA在作为小分子药物治疗疾病方面具有巨大的潜力。

3.2 siRNA加工机制

内源siRNA由双链RNA（dsRNA）前体加工形成。在植物、真菌、线虫及果蝇等低等动物体内存在一种特殊的RNA聚合酶RDRP（RNA-dependent RNA polymerase），在其作用下可将单链RNA转变成dsRNA，然后被细胞内的Dicer识别并在协助蛋白TRBP的作用下切割加工产生双链siRNA，但大部分动物体内没有这种酶。后来发现动物虽然不能通过RDRP形成dsRNA，但可以通过反转座子转录 、天然反义转录等方式产生形成dsRNA前体，从而产生内源siRNA[51]。

内源性siRNA主要来源于反转座子。序列相同的2个转座子基因沿相反方向转录产生的单链RNA可以形成互补的dsRNA，dsRNA出核后进入细胞质，再经Dicer酶剪切成siRNA[52-53]。研究发现，不同物种在siRNA加工产生的区域上区别很大，比如在果蝇体内，1个转座子的整个转录产物都能形成siRNA[54]；而在日本血吸虫体内，siRNA只来源于转座子转录产物的部分区域[55]。因此，物种不同siRNA的产生机制可能也不完全相同。

另外某些基因在基因组上存在反义链转录本，当2条链同时被转录出来后[54]，正义链与反义链RNA形成dsRNA，该双链RNA进入细胞质后经过Dicer酶剪切加工后可以形成siRNA。

外源siRNA有以下几种来源：①由短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）加工形成，外源性shRNA一般采用H1、U6等启动子，在细胞内RNA聚合酶III的作用下转录产生shRNA。shRNA有21～25 bp的碱基互补配对区域，在转运蛋白Exportin-5和协助因子Ran-GTP的作用下转运出核，在细胞质中被Dicer和协助蛋白TRBP识别并剪切，形成双链siRNA[56-57]；②由shRNAmir加工形成，參照miRNA的加工途径，把pri-miRNA中的miRNA序列改为siRNA序列，在RNA聚合酶II启动子（CMN、EF1、CAG、TRE等 ）的作用下转录产生类似pri-miRNA结构的siRNA前体shRNAmir。这类前体可通过类似miRNA加工合成途径，经Drosha及Dicer酶加工剪切后最终形成双链RNA[58-59]；③体外直接合成，在体外可以人工直接合成siRNA，然后通过转染的方法将21 bp的siRNA导入哺乳动物体细胞也能够导致靶基因的沉默。这类siRNA，可通过碱基修饰的方法增加在细胞内的稳定性。

不管是外源导入还是细胞内加工形成的siRNA在细胞质内都与AGO家族的AGO2结合，其中siRNA的3′端结合AGO2蛋白的PAZ结构域，5′端结合AGO2蛋白的MID结构域[60]，形成RISC复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）。RISC复合体通过siRNA与靶标mRNA完全互补配对，在镁离子和ATP的作用下，AGO2利用自身的核酸内切酶活性切割靶标RNA，产生的RNA片段受到5′或3′核酸外切酶的攻击而迅速降解，从而达到转录后水平沉默靶基因的目的[61-62]。

4 3类小RNA之间的联系与区别

虽然3类小RNA转录本长度都不超过40 nt，且都需要与AGO蛋白家族相互作用才能发挥功能，但三者之间还是存在一些区别：①在来源上，miRNA 是由不完全配对的发夹结构前体，经Drosha和Dicer酶加工而成；siRNA是由完全互补的长双链RNA或发夹RNA，直接经Dicer酶剪切而成；piRNAs是由单条长链RNA前体加工形成，其过程不需要Drosha和Dicer酶的参与，其加工过程相比于前两者更为复杂；②piRNA目前只在动物界发现，而siRNA、miRNA在动物和植物体内均存在；③在特征上，多数miRNA 具有很强的保守性、组织特异性和时序性；siRNA在序列识别方面具有高度特异性；piRNA的表达具有组织特异性，但其保守性较差，这一特性可能是为了更好地适应其抑制转座子的功能；④在结合位点上，miRNA主要结合mRNA的3′UTR区；siRNA可结合在mRNA的任何部位，并且与mRNA完全互补配对；piRNA主要作用于转座子序列；⑤在作用方式上，miRNA可以抑制mRNA的翻译，也可以导致靶标RNA降解；siRNA主要导致靶标RNA的快速降解，也可以通过表观遗传水平，抑制靶标RNA的转录；而piRNA可在转录水平和转录后水平同时沉默转座子等基因组自私性遗传元件。

之前认为 miRNA、piRNA和siRNA三者作用途径没有联系，并且它们之间存在明显的区别。但近年来的研究表明，这些作用途径之间有一部分存在交互影响 （reference），从而构成了一个高度复杂的RNA调控网络，在表观遗传学水平、转录水平、转录后水平调控基因表达，保证有机体的正常生命活动。

5 问题及展望

曾经普遍认为基因组上的大量非编码序列都是没有任何功能的“垃圾序列”，在过去很长的一段时间内，这些序列始终没有得到科学界足够的重视，miRNA、siRNA以及piRNA等小RNA的发现，推翻了人们之前对非编码区序列的认知，成为了RNA研究领域的一项重大突破。这一突破打开了小分子RNA的大门，小RNA调控生命活动成为一种新的重要调控机制，这也使得基因的表达调控网络变得更加复杂，为复杂的生物进化提供了基础。

目前随着对小RNA研究的不断深入，新的类型小RNA分子不断出现在大家的视野中，已知的小RNA的功能与作用机制也在不断地更新完善。与siRNA和piRNA相比，miRNA的发现相对较早，因此miRNA的作用机理也相对比较清楚，但仍有很多miRNA的功能是不清楚的。随着对miRNA作用机制研究的不断深入，结合现有的高通量测序技术等手段，人们对生物基因表达调控網络的认识也在不断加深，这也为疾病的诊断、预后与治疗提供理论依据和应用基础；对于siRNA，随着对RNA干扰技术的深入了解，siRNA的作用机制被不断完善，其作为基因靶向沉默治疗的潜力也在被不断挖掘，但就目前来看，依旧存在一些问题，例如由于miRNA和siRNA在加工成熟时都要用到细胞内源的Drosha、Dicer和Exportin-5等蛋白因子，细胞内过表达siRNA时就会对miRNA的表达造成竞争压力，因此如何协调两者之间的关系成为RNA载体设计的挑战之一。其次，由于RNAi存在脱靶现象，可能会对细胞内很多非靶向基因的表达造成影响，虽然已经存在一些技术能够减少脱靶所带来的副作用，但如何更大程度甚至完全消除毒副作用，还有待于进一步研究。另外piRNA的发现无疑是为小RNA的研究开辟了一片新领域。迄今为止，尽管关于piRNA的研究已经取得了相当大的进展，但由于piRNA发现较晚，其生物合成途径及调控机制仍然有待于进一步完善，比如初级加工途径与次级加工途径中的具体加工细节，piRNA如何调控基因表达等。

小RNA的发现与功能补充和完善了中心法则，促使科研人员重新思考细胞的调控与发育问题。随着对这些小RNA认识不断深入，RNA干扰技术也越来越完善，为新型RNAi治疗提供新的理论基础，对于小RNA在生命起源与进化、生长发育、疾病治疗等方面也将有更加深入的了解与把握。总而言之，在之后的研究当中通过结合小RNA的加工机制改造RNAi载体等RNA分子机器以提高效率，减少或消除对机体的副作用，从而能够将RNAi技术运用到更广泛的领域当中。

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