诺丽叶片的离体再生

黄奥丹 蓝增全 吴田

摘要： 以诺丽（Morinda citrifolia）叶片为外植体，在添加不同激素种类和浓度的MS培养基上进行离体培养，建立两种离体再生模式：模式Ⅰ为先脱分化愈伤组织，再分化不定根和不定芽；模式Ⅱ为直接培养生根后分化不定芽。结果表明：在模式Ⅰ中，诱导诺丽叶片产生愈伤组织的最优培养基为MS + 0.1 mg·L1 6BA + 2.0 mg·L1 2，4D；诱导叶片愈伤组织再分化出不定根和不定芽的最优培养基为MS +1.0 mg·L16BA+ 0.4 mg·L1 NAA或MS +2.0 mg·L16BA+ 0.4 mg·L1 NAA，其中MS + 1.0 mg·L16BA + 0.4 mg·L1 NAA生根時间最早为10 d左右，根系较发达，而MS + 2.0 mg·L16BA + 0.4 mg·L1 NAA生根时间在15 d左右，根系发达。在模式Ⅱ中，诱导叶片直接生根长芽的培养基为MS + 1.0 mg·L16BA + 0.4 mg·L1 NAA。将模式Ⅰ和模式Ⅱ中，完成诺丽叶片离体再生的苗切下后接种到MS + 0.2 mg·L1 NAA培养基中诱导生根，15 d左右分化出不定根，45 d获得完整植株。该研究结果为后续的遗传转化和基因改良研究奠定了基础。

关键词： 诺丽， 植物激素， 愈伤组织， 再生培养

中图分类号： Q943.1

文献标识码： A

文章编号： 10003142（2017）06074908

Abstract： Using noni （Morinda citrifolia） leaves as explant for culture in vitro on 3% MS medium with different types and concentrations of plant hormones， two kinds of in vitro regeneration modes were built. Mode Ⅰ： the callus was induced first， and then the adventitious roots and buds were induced； Mode Ⅱ： the adventitious roots were induced， and then the buds were induced directly. The results showed that the optimal medium of generating callus by noni leaves in Mode I was MS + 0.1 mg·L1 6BA + 2.0 mg·L1 2，4D； the optimal medium that induced leaf callus to generate adventitious roots and buds was MS + 1.0 mg·L1 6BA+ 0.4 mg·L1 NAA or MS + 2.0 mg·L1 6BA + 0.4 mg·L1 NAA， Thereinto， the solution of MS + 1.0 mg·L1 6BA + 0.4mg·L1 NAA made the rooting time earler， about 10 d， and its root system was more developed. Instead， the solution of MS + 2.0 mg·L1 6BA + 0.4 mg·L1 NAA made it 15 d. The optimal medium that induced leaves to generate roots and buds in mode Ⅱ was MS + 1.0 mg·L1 6BA + 0.4 mg·L1 NAA。Cutting and transplanting the seedlings regenerated in vitro from model Ⅰ and Model Ⅱ into MS + 0.2 mg·L1 NAA medium to induce rooting. Getting the differentiation of adventitious root about 15 d and complete plant 45 d. This study provides useful references for the breeding and the application of genetic transformation technique in noni.

Key words： noni， plant hormones， callus， regeneration of culture

诺丽（Morinda citrifolia）又称海滨木巴戟、海巴戟天、檄树（吴田和蓝增全，2011；曹艳花，2014），为茜草科（Rubiales）巴戟天属（Morinda）植物（杨小波2013），是一种热带常绿多年生阔叶灌木或小乔木。主要生长于温暖潮湿的热带、亚热带地区，在国外主要分布于南太平洋诸岛，如大溪地、夏威夷、印度尼西亚等，在我国主要生长于海南岛、西沙群岛、云南西双版纳及台湾南部等地区（何明霞和杨清，2006）。现代医学研究证明， 诺丽果汁中具有免疫调节及抗肿瘤作用的多糖成分（张学梅，2000）， 果实单用或与其他植物合用可治疗多种疾病，被医学研究者称为当代神奇的治疗物质（赖茂良，2014）、（段文荣等，2009），有较高的经济价值。

早在2000多年前，波利尼亚人就用诺丽叶片治疗疾病（张伟敏等，2008），以及为服装染色（白飞荣等，2015）。诺丽鲜叶可以直接咀嚼，或者加水熬汁或浸泡饮用，也可晒干磨成粉末。在巴西诺丽叶被称为“止痛草”，其对牙龈炎、牙周病、喉痛、感冒、头疼、骨折、皮肤病等均有一定功效（杨焱等，2009）。吴田和蓝增全（2011）以带腋芽的茎段为外植体对诺丽进行离体培养，建立了高效的离体快速繁殖体系；谢江等（2012）和潘晓晴等（2014）分别以根和不带腋芽的茎段为外植体，进行诺丽离体再生培养研究；而以诺丽叶片为外植体的离体培养研究还未见报道。无菌培养条件下，诺丽根较细，诺丽茎段较短，而诺丽叶片较大，作为外植体更容易获得。因此，本研究以诺丽无菌试管苗叶片为外植体，进行离体再生培养研究，以期为后续的遗传转化及基因改良研究奠定基础。

1材料与方法

1.1 材料

实验材料为西南林业大学园林学院组培室的诺丽无菌试管苗，取健康、无菌诺丽苗的叶片为外植体。试管苗每90 d左右继代一次，继代培养基为MS + 0.2 mg·L1 NAA。

1.2 培养基配制

以MS为基本培养基，添加不同浓度的6BA、NAA及2，4D，共设计38种培养基（表1）；再加琼脂0.6%、蔗糖3%，pH 5.8，分装，121 ℃灭菌20 min。

1.3 接种与培养

将诺丽无菌苗叶片，剪去叶尖和叶缘，剪成0.5 cm × 0.5 cm方片，正面向上放于离体再生培养基上，确保其与培养基充分接触。每瓶培养基中接种5块叶片，每种培养基接种10瓶。接种后，将材料置于光照强度1 500 lx（12 h·d1）、温度（28 ± 2）℃的条件培养。培养过程中每5 d观察1次，统计培养物的形态、颜色和生长情况。以上实验重复3次。

1.4 离体再生苗生根

将长至2～4 cm的诺丽叶片离体再生苗茎尖切下后，在MS + 0.2 mg·L1 NAA培养基上继续诱导生根。观察生根时间和过程，最终获得完整植株。

1.5 数据分析

愈伤组织诱导率（%）=产生愈伤组织的外植体数/成活的外植体数；不定根分化率（%）=不定根分化的外植体数/成活外植体数；不定芽分化率（%）=不定芽分化的外植体数/成活外植体数。

数据用Microsoft Excel 2003和SPSS 19.0统计软件进行计算和方差分析，在方差分析的基础上，用Duncan法进行多重比较分析。

2结果与分析

2.1 先诱导脱分化愈伤组织，再诱导不定根和不定芽

2.1.1 不同激素组合对叶片愈伤组织诱导影响由方差分析可知，不同激素组合对叶片愈伤组织的诱导存在一定影响（表2）。叶片在6BA和2，4D配合使用的培养基上，脱分化能力较好，可在20 d左右形成嫩黄色接近透明的疏松的愈伤组织（图1： A）。在6BA浓度分别为2.0、3.0 、4.0 mg·L1同时配合使用NAA的培养基上，在培养15 d左右沿叶片主脉出现膨大，并逐渐形成愈伤组织。当6BA浓度为2.0 mg·L1，NAA浓度分别为0.1、0.2 、0.3 mg·L1时，叶片能诱导出黄白色颗粒，质地疏松的愈伤组织（图1： B），但愈伤组织脱分化能力一般。当6BA浓度为3.0 mg·L1，NAA浓度为0.1、0.2 、0.3 mg·L1时，叶片能诱导出嫩绿色愈伤组织（图1： C）。当NAA浓度高于0.3 mg·L1时， 愈伤组织为黄褐色（图1： D）。当6BA浓度高于4.0 mg·L1时，愈伤组织为黄褐色且脱分化能力弱诱导率低。将诱导出的愈伤组织转接至原培养基中继续增殖继代培养，每20 d更换一次新鲜培养基，除6BA和2，4D配合使用的培养基，愈伤组织可在继代培养基中不断增殖，且愈伤组织质地更加疏松呈泥状，黄色接近透明；其余在6BA和NAA配合使用的培养基上继代，愈伤组织增殖能力较弱，并逐渐褐化死亡。在6BA浓度为0.1 mg·L1，2，4D浓度为2.0 mg·L1时，愈伤组织脱分化能力最好，诱导的愈伤组织质地松散成泥状、黄色接近透明，诱导20 d、诱导率高达96.67%，并可不断增殖继代培养。因此，诱导诺丽叶片产生愈伤组织的最优培养基为MS + 0.1 mg·L1 6BA + 2.0 mg·L1 2，4D。

2.1.2 不同激素组合对诺丽叶片愈伤组织不定根不定芽诱导影响将诺丽叶片愈伤组织转移至芽或根诱导培养基中（表3），发现单独使用6BA无任何不定芽或不定根分化，而配合使用了NAA的培养基，在6BA浓度1.0～2.0 mg·L1之间，不定根分化率随NAA浓度的增加而升高；在6BA浓度3.0～4.0 mg·L1之间，不定根分化率随NAA浓度的增加而减低。同时，在6BA浓度1.0 mg·L1，NAA浓度0.4 mg·L1和6BA浓度2.0 mg·L1，NAA浓度0.4mg·L1时芽分化率最高达70.67%（P>0.05差异不显著）。

通常在分化培养基培养10～15 d左右，开始分化不定根（图2： A），而后长出发达根系（图2： B）；40 d左右时分化出不定芽（图2： C）。综合不定根和不定芽分化两方面因素，诺丽叶片愈伤组织不定根不定芽诱导最佳培养基为MS + 1.0 mg·L1 6BA + 0.4 mg·L1 NAA或MS + 2.0 mg·L1 6BA + 0.4 mg·L1 NAA，兩种培养基之间不定芽分化率差异不显著（P>0.05），其中MS + 1.0 mg·L1 6BA+ 0.4 mg·L1

NAA生根时间为10 d左右，根系较发达；而MS + 2.0 mg·L1 6BA+ 0.1 mg·L1 NAA生根时间在15 d左右，根系发达。

2.2 直接诱导生根后诱导不定芽

叶片在6BA浓度为1.0～2.0 mg·L1的培养基中培养10～15 d，不定根沿叶片主脉处分化（图3： A），随后长成发达根系（图3： B）；培养50 d左右分化出不定芽（图3： C），最终完成离体再生（图3： D）。其中6BA浓度1.0 mg·L1、NAA浓度0.4 mg·L1时，芽和根的分化率分别为66.67%和74%。综合不定根和不定芽分化两方面因素，离体叶片再生最佳培养基为MS + 1.0 mg·L1 6BA + 0.4 mg·L1 NAA。

2.3 离体再生苗生根

将诺丽叶片完成离体再生的苗切下后接种到MS + 0.2 mg·L1 NAA培养基上继续诱导生根，10 d左右在切口处形成愈伤组织，15 d后分化出不定根（图4： A），30 d左右分化出根系（图4： B），45 d后获得再生苗完整植株（图4： C）并分化出发达根系（图4： D）。

3讨论与结论

3.1 不同种类激素对叶片分化的影响

本研究以诺丽叶片为外植体， 首次建立了诺丽叶片离体培养体系，并建立两种不同的再生模式。对于叶片离体再生而言，外植体确定后，影响其再生率的最关键因素为激素。再生培养基中必须同时具有细胞分裂素类和生长素类物质（周瑞金和刘孟军，2003），在不同生长素和细胞分裂素的配合使用中，两者的比例十分重要（孙俊，2014）。本研究中在MS培养基中单独添加6BA，叶片不能分化不定根和不定芽，在同时添加6BA和NAA两种激素后完成了叶片离体培养，说明诺丽叶片离体培养中这两种激素配合使用效果较好，与大多数木本植物的研究结果一致（Chen & Hsia，2006）。培养基中激素的种类、浓度、配比不同造成生长能力和分化方向不同，可能是因为它们刺激了不同基因控制的酶类，从而影响内源激素的分布水平，进而在生长和分化上形成差异（黄学林和李筱菊，1986）。

3.2 不同种类生长素和浓度对叶片离体再生方式的影响

生长素的种类和浓度影响离体叶片分化不定芽的途径，即是直接由叶片分化不定芽，还是先形成愈伤组织再分化不定芽（丁爱萍和王洪范，1996）。本研究以诺丽叶片为外植体，建立了两种离体再生模式（模式Ⅰ为先诱导愈伤组织后诱导不定根不定芽；模式Ⅱ为不通过愈伤组织直接诱导不定根后诱导不定芽）。诺丽叶片离体培养过程中，无论是哪种再生模式，愈伤组织、不定芽和不定根都是在主脉处形成，分析其原因，可能是双子叶植物叶片主脉含有维管束，在维管束的木质部和韧皮部之间还存在形成层（李扬汉，1984），形成层细胞可能具有较强的分生和再生能力（柴慈江等，2011），所以促进了愈伤组织、不定根和不定芽的形成。欧阳超等（2014）的研究发现，含主脉的叶块其愈伤组织诱导率明显高于不含主脉叶块；Vieitez（1996）等研究指出，清水钢叶片离体培养中，不定芽的形成主要在叶柄和主脉形成的愈伤组织上分化。本研究中模式Ⅰ和模式Ⅱ的离体培养时间分别为65 d和50 d，两种模式使用的诱导时间差异主要是由于模式Ⅰ诱导愈伤组织的时间在20 d左右，模式Ⅱ利用诺丽叶片直接再生不定芽体系，未经愈伤组织，简化了操作步骤，缩短了不定芽再生时间。

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