菊花CmAP1基因克隆及其植物表达载体构建

梁芳 黄萍 袁秀云 崔波 李霞

摘要：【目的】克隆菊花CmAPETALA1基因（CmAP1）并构建植物表达载体，为该基因功能的遗传改良打下研究基础。【方法】采用同源克隆及RT-PCR从菊花叶片中克隆CmAP1基因，运用在线生物信息学分析工具对其核苷酸及氨基酸序列进行分析，利用实时荧光定量PCR对该基因的组织表达差异进行分析，并用双酶切法将目的基因与pCAMBIA1300载体连接，构建植物表达载体。【结果】克隆获得的CmAP1基因（GenBank登录号KU872999）编码区开放阅读框（ORF）长741 bp，编码246个氨基酸；CmAP1蛋白属亲水性蛋白，分子质量约28.3 kD、理论等电点（pI）为8.76，预测该蛋白内含10个磷酸化位点和2个潜在的N-糖基化位点；蛋白氨基酸序列比对和系统发育进化分析结果表明，CmAP1蛋白与CDM111蛋白的同源性达98%，属MADS-box基因家族A类基因的euAP1分支；实时荧光定量PCR分析结果表明，CmAP1基因在花蕾中表达量极高，在舌状花和筒状花中表达量较低，而在营养器官中仅痕量表达。将CmAP1基因连接到pCAMBIA1300载体上，可成功构建植物表达载体pCAMBIA1300-CmAP1。【结论】CmAP1基因在花的发育及形成过程中发挥重要作用，成功构建获得的植物表达载体pCAMBIA1300-CmAP1可为后期利用基因工程手段改變菊花花形态结构、调控花期及遗传改良打下基础。

关键词： 菊花；CmAPETALA1（CmAP1）；基因克隆；植物表达载体；生物信息学

中图分类号： S682.11 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）06-0000-08

Cloning of CmAP1 gene from Chrysanthemum morifolium and establishment of its plant expression vector

Abstract：【Objective】CmAPETALA1 gene（CmAP1） in Chrysanthemum morifolium was cloned and its plant expression vector was established， in order to provide references for further study on genetic improvement of CmAP1 gene function. 【Method】CmAP1 gene was cloned from leaf of C. morifolium by method of homology cloning and RT-PCR. The nucleotide and amino acid sequence were analyzed by online bioinformatics tool. Expression difference of this gene was determined by real-time fluorescence quantitative PCR. CmAP1 gene was linked to pCAMBIA1300 vector by double enzyme digestion to establish plant expression vector. 【Result】CmAP1 gene（GenBank accession number：KU872999） was obtained by cloning. The open reading frame（ORF） of CmAP1 was 741 bp encoding 246 amino acids. CmAP1 protein was a hydrophilic protein，and the molecular weight of this protein was about 28.3 kD. Its theoretical isoelectric point（pI） was 8.76. It was predicted that the protein contained ten phosphorylation sites and two potential N-glycosayation sites. Sequence and phylogenic analysis showed that CmAP1 protein was close to C. morifolium CDM111 protein with 98% similarity， which both belonged to euAP1 clade of A type gene in MADS-box gene family. Real fluorescence quantitative PCR analysis indicated that expression of CmAP1 gene was extremely high in buds. The expression level was low in tubiform and lingulate florets and was in trace expression in vegetative organs. CmAP1 was linked to pCAMBIA1300 vector and the plant expression vector pCAMBIA1300-CmAP1 was established successfully. 【Conclusion】CmAP1 gene plays an important role in growth and development of C. morifolium. The established plant expression vector pCAMBIA1300-CmAP1 is useful for further research on changing morphological structure of C. Morifolium by genetic engineering， regulation of flowering and genetic modification.

Key words： Chrysanthemum morifolium； CmAPETALA1（CmAP1）； gene cloning； plant expression vector； bioinformatics

0 引言

【研究意义】成花过程是植物从营养生长向生殖生长转折的关键期。调控植物成花过程的基因分为花序分生组织特征基因、花分生组织特征基因和花器官形态特征基因。大部分花器官形态特征基因属于MADS-box转录因子家族基因，其中APETALA1/FRUITFULL（AP1/FUL）亚家族被认为既是花分生组织特征基因，又是花器官特征基因。AP1基因是花瓣和萼片正常发育的必需基因（Alvarez-Buylla et al.，2006）。菊花（Chrysanthemum morifolium）是重要的短日照作物之一，多数品种在自然条件下于每年10～11月开花，温室种植的菊花需人工调控光照周期，成本较高，而通过分子育种可缩短菊花对短日照的响应时间，有效降低温室供热及人力物力等生产成本。因此，克隆菊花AP1基因（CmAP1）并进行植物表达载体构建对其基因功能的遗传改良具有重要意义。【前人研究进展】迄今，已有很多植物的AP1同源基因被分离克隆，如马铃薯（樊春媛等，2010）、草莓（邹冬梅等，2012）、萼脊兰（崔波等，2013）、梨（Liu et al.，2013）、荷花（Kong et al.，2015）等。Ellul等（2004）将拟南芥AP1基因转入番茄中，转基因番茄营养生长期缩短，开花期比对照提前，且不影响植株正常发育。烟草中异源表达大豆AP1基因，表现为提前开花及花器官改变（Chi et al.，2011）。白桦AP1基因过表达能引起早花，且影响很多开花相关基因的表达及二萜化合物的生物合成（Huang et al.，2015）。在菊花MADS-box基因研究方面，Shchennikova等（2004）从菊花中分离出3个AP1/FUL亚家族基因CDM111、CDM8和CDM41及1个SEPALLATA3亚家族基因CDM44；Shulga等（2011）将CDM111、HAM75和HAM92基因分别转入菊花中，在长日照条件下转基因植株与对照在表型上无差异，短日照条件下花芽启动比对照提前两周，且转基因植株花色着色更早；Shchennikova等（2011）克隆出菊花AGAMOUS的同源基因CDM37，该基因能促进萼片中蜜腺的发育。此外，将菊花CDM41（Goloveshkina et al.，2012）、CIM8（Wang et al.，2013）和SOC1（Fu et al.，2014）基因分别转入烟草和拟南芥中，均可使烟草和拟南芥提前开花且引起花形态异常。【本研究切入点】目前，针对AP1同源基因克隆和生物信息学分析及植物表达载体构建的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以菊花晚花品种狮子头为试验材料，利用RT-PCR克隆CmAP1基因，并对该基因核苷酸及其推导氨基酸序列进行生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR对开花期菊花不同器官中该基因的表达量进行定量分析，构建植物表达载体pCAMBIA1300-CmAP1，以期为CmAP1基因功能的遗传改良提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 植物材料 供试菊花品种为黄色大花品种狮子头，由郑州好日子园艺有限公司提供；试验于2015年10月～2016年4月在郑州师范学院生物工程研究所进行。取其叶片进行基因克隆，在盛花期分别取健康植株的根、茎、叶、花蕾、管状花及舌状花，用于分析目的基因在不同部位的表达量。所有材料迅速用液氮冷冻，-80 ℃保存备用。

1. 1. 2 菌株和质粒 大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、根癌农杆菌（Agrobactrium tumefaciens）EHA105及植物表达载体pCAMBIA1300由郑州师范学院生物工程研究所分子实验室保存提供，pGEM-T Easy Vector购于宝生物工程（大连）有限公司。

1. 1. 3 酶与化学试剂 XbaⅠ及SmaⅠ限制性内切酶、rTaq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、dNTPs、DNA Marker等购自宝生物工程（大连）有限公司。琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 引物设计 运用Primer Premier 5.0和DNAMAN，根据NCBI上已登录的菊科植物AP1基因序列ORF两端设计引物CmAP1-F和CmAP1-R（表1）；为构建真核表达载体，在引物5'端分别加上Xba I和Sma I酶切位点。

1. 2. 2 CmAP1基因克隆 采用Trizol（Invitrogen公司）试剂提取叶片总RNA。以提取的总RNA反转录合成的cDNA第一链为模板，根据设计合成的引物进行PCR扩增。PCR反应体系20.0 μL：ddH2O 13.2 μL、10×PCR Buffer 2.0 μL、dNTP（2.5 mmol/L）1.6 μL、CmAP1-F和CmAP1-R（10 mmol/L）各1.0 μL、cDNA 1.0 μL、rTaq DNA聚合酶0.2 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶检测及回收，目的片段大小为756 bp。将回收的目的片段再经凝胶电泳检测正确后，连接到pGEM-T载体上，然后转入DH5α感受态细胞中，经蓝白斑筛选及菌落PCR鉴定，阳性菌液送至上海英骏生物技术有限公司测序。

1. 2. 3 实时荧光定量PCR 根据克隆获得的CmAP1基因序列，重新设计实时荧光定量PCR引物qRT-F和qRT-R，以Actin基因（GenBank登錄号AB770471）为内参基因，设计引物（表1）对CmAP1基因在不同组织部位的表达进行分析。分别提取根、茎、叶、花蕾、管状花及舌状花的总RNA，用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（TaKaRa）反转录合成cDNA第一链。采用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ Kit（TaKaRa）进行实时荧光定量PCR扩增，反应体系20.0 μL：2×SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ10.0 μL、qRT-F和qRT-R各0.8 μL、cDNA 1.0 μL，ddH2O 7.4 μL。扩增程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，进行40个循环。每个样品3次重复，并设阴性对照。CmAP1相对表达量Rel.Exp=2-△△C t，其中△C t=C t（CmAP1）-

C t（Actin），△△C t=（各植物组织△C t）-（根△C t）。

1. 2. 4 CmAP1過表达载体构建 将测序正确的阳性菌液扩摇并进行PCR扩增，提取质粒pGEM- CmAP1，经限制性内切酶Xba I和Sma I酶切后，回收约750 bp的目的片段；同时pCAMBIA1300载体也用Xba I和Sma I进行酶切，回收大片段。将回收的目的片段和表达载体片段用T4 DNA连接酶于16 ℃下连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落，重组质粒命名为pCAMBIA1300-CmAP1。提取质粒后进行双酶切鉴定，以确定植物表达载体构建成功，正确者将其质粒重组DNA转化农杆菌EHA105感受态细胞，28 ℃培养2 d后，挑取单菌落进行两次PCR鉴定，均为阳性者确定为阳性转化子，-80 ℃保存或用于后续的农杆菌侵染试验。

1. 2. 5 生物信息学分析 利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）对CmAP1蛋白的理化性质进行分析，用Protscale（http：//web.expasy.org/protscale.html/）对蛋白亲疏水性进行分析；通过NCBI的CDD数据库对蛋白序列进行结构域分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.

gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）。采用NetPhos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）和NetNGlyc 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）分别分析磷酸化位点和N-糖基化位点。用ExPASyGOR4 Secondary Structure Prediction Method（https：//npsa-

prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）对蛋白的二级结构进行预测，利用SWISS-

MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）同源建模方法对该蛋白三级结构进行预测；利用DNAMAN进行蛋白同源序列多重比对分析。从NCBI下载已知菊科所有MADS-box A类基因，采用ClustalX进行核酸序列比对，然后采用MEGA 6.0以邻接法构建基于CmAP1基因的系统发育进化树。

2 结果与分析

2. 1 CmAP1基因ORF的克隆

以菊花叶片cDNA为模板，利用引物对CmAP1-F和CmAP1-R进行PCR扩增，得到预期片段（756 bp），其ORF长741 bp，编码246个氨基酸（图1）。在NCBI上进行BLASTN在线分析，发现此序列与其他已登录菊花AP1基因（AY173054、AB808650、AB808649、JX87-

2512、AB808648、AB808647和AB679275）的同源性均为99%，与向日葵（Helianthus annuus）AP1基因（AY173071、GU985582、GU985583和AF462152）的同源性为89%～90%，与非洲菊（Gerbera hybrid cultivar）AP1基因（AJ009727和FN298388）的同源性为83%～87%，故将该基因命名为CmAP1，GenBank登录号KU872999。

2. 2 CmAP1蛋白的基本理化性质

CmAP1蛋白氨基酸序列的CDD分析结果（图2）显示，CmAP1蛋白氨基酸序列具有典型的MEF2_like MADS结构域和K-box结构域，MADS结构域位于CmAP1蛋白N端第2～75位氨基酸，K-box结构域位于第89～167位氨基酸，说明CmAP1基因是植物典型的MIKCC-Type MADS-box基因。

基于K-D法的CmAP1蛋白亲疏水性预测结果见图3，正值为疏水区，负值为亲水区，多肽链第36～52位的氨基酸区域为疏水性最强区域，第46位的异亮氨酸（Ile）疏水性最强，分值最高，为2.089；第173位的谷氨酸（Glu）和第174位的精氨酸（Lys）分值最低，均为2.833，亲水性最强。整条多肽链中亲水性氨基酸较多，故表现为亲水性。

ProtParam分析结果表明，CmAP1分子质量约28.3 kD、理论等电点（pI）为8.76，分子式为C1227H1976N362O385S11；负电荷残基总数（Asp+Glu）为33，正电荷残基总数（Arg+Lys）为37。在组成CmAP1蛋白的20种氨基酸中，亮氨酸（Leu）所占比例最高，为10.6%，色氨酸（Trp）所占比例最低，为0.8%。该蛋白的不稳定指数为52.08，半衰期30 h，脂肪指数为73.33，根据Guruprasad判定，CmAP1蛋白不稳定。NetPhos 2.0 Server预测结果表明，CmAP1蛋白序列中存在10个潜在的磷酸化位点，包括6个Ser位点（22Ser、61Ser、74Ser、89Ser、99Ser和120Ser），3个Thr位点（76Thr、86Thr和168Thr）和1个Tyr位点（191Tyr）。NetNGlyc 1.0 Server预测结果表明，CmAP1蛋白存在2个潜在的N-糖基化位点，分别为164Asn和214Asn。说明蛋白翻译后修饰对CmAP1蛋白功能的实现起重要作用。

2. 3 CmAP1蛋白二级和三级结构的预测分析结果

采用GOR4进行CmAP1蛋白二级结构预测，结果表明，CmAP1蛋白二级结构由α螺旋、伸展链和无规则卷曲组成，其中，α螺旋（Hh）占54.88%，β折叠（Ee）占15.04%，无规则卷曲（Cc）占30.08%（图4）。采用SWISS-MODEL同源建模方法对CmAP1蛋白三级结构进行预测，以3p57.1.A为模板，序列一致性为50.68%，三级结构详见图5，即CmAP1蛋白由α螺旋、β折叠和无规则卷曲组成。

2. 4 CmAP1蛋白氨基酸序列比对及系统发育分析结果

CmAP1蛋白与菊科其他AP1蛋白氨基酸序列的比对分析结果（图6）表明，CmAP1蛋白序列与甘野菊（C. seticuspe，BAL14662）的序列完全相同，与向日葵HAM75（Helianthus annuus，AAL83209）蛋白的同源性为93%，与菊花CDM111（AAO22979）的同源性为98%，与非洲菊GSQUA3（Gerbera hybrid cultivar，CAX65662）的同源性为88%。

为进一步分析CmAP1基因与菊科及模式植物拟南芥MADS-box A类基因的进化关系，构建基于CmAP1基因的系统发育进化树（图7）。从图7可看出，所有的CmAP1基因可分为三大分支，甘野菊的CsAFL1基因（AB679273）和CsM8基因（AB770472）、菊花的CmAFL1基因（AB451218）和cdm8基因（AY173056）、甘菊（C. lavandulifolium）的AP1-like基因（HM130686）及拟南芥AGL8基因（ATU33473）同属euFUL分支；甘野菊的AP1/FUL-like基因（AB839770）、菊花的cdm41基因（AY173055）和CmFUL基因（KT894379）及拟南芥AGL79基因（NM_113925）同属FUL-like分支；其他菊花AP1基因则与拟南芥AP1基因（NM_105581）及CAL基因（NM_102395）同属euAP1分支。在euAP1分支中，向日葵的3个euAP1基因（AF462152、GU985592和GU985583）自成一个小分支，另一个分支则全部为菊科的euAP1类基因，说明euAP1基因的进化具有明显种属特异性。

2. 5 CmAP1基因在不同组织部位的表达情况

用Trizol法提取各组织部位的总RNA，以Actin基因为内参基因，利用实时荧光定量PCR对菊花花期不同组织部位CmAP1基因的表达量进行分析，结果显示，各溶解曲线峰单一；CmAP1基因在花蕾中表达丰度最高，其次是管状花和舌状花，在根茎叶中均为痕量表达（图8）。说明CmAP1基因可能在花的发育及形成中发挥重要作用。

2. 6 CmAP1基因植物表达载体的构建

将测序成功的质粒pGEM-CmAP1经Xba I和Sma I限制性内切酶酶切后，得到两个目的片段，分别为756和约3000 bp（图9），切胶回收小片段；质粒pCAMBIA1300经Xba I和Sma I酶切后，切胶回收大片段。将回收的pCAMBIA1300大片段与pGEM-CmAP1的小片段用T4 DNA连接酶连接，然后转入DH5α感受态细胞。阳性转化子经质粒酶切鉴定，得到一条长756 bp的小片段和一条长约10000 bp的pCAMBIA1300载体片段（图10）；测序验证结果表明，植物表达载体pCAMBIA1300-CmAP1构建成功。用冻融法将pCAMBIA1300-CmAP1质粒转化农杆菌EHA105感受态细胞，28 ℃培养2 d后，挑取单菌落进行PCR鉴定。电泳结果（图11）显示，约在750 bp处有很亮的目的条带，说明转化子为阳性，CmAP1基因已成功转入农杆菌中。

3 讨论

通过同源克隆从菊花中克隆获得的AP1同源基因（命名为CmAP1），其ORF长741 bp，编码246个氨基酸；CmAP1蛋白属于亲水性蛋白，分子质量约28.3 kD、理论等电点（pI）为8.76，预测该蛋白内含10个磷酸化位点和2个潜在的N-糖基化位点；利用SWISS- MODEL同源建模方法对CmAP1蛋白三级结构进行预测，以3p57.1.A为模板，二者序列一致性为50.68%，表明CmAP1蛋白由α螺旋、β折叠和无规则卷曲组成；氨基酸序列比对分析结果表明，CmAP1基因属于MADS- box的AP1/FUL亚家族，与菊花CDM111序列一致性为98%，与向日葵HAM75序列一致性为93%。Litt和Irish（2003）、Shan等（2007）研究认为，AP1/FUL-like基因經过长期进化和基因复制产生euAP1、euFUL和FUL-like（AGL79）三大分支，本研究中的CmAP1基因属于其中euAP1基因进化枝，euAP1类基因的进化具有明显的种属特异性，表明AP1基因在进化上具有高度保守性。Becker和Thei？茁en（2003）、Kaufman等（2005）研究表明，MADS-box基因依据进化及结构可分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅱ型又分为动物和真菌的MEF2-like型和植物的MIKC型，多数已知植物的MADS-box基因均属于MIKCC型，其编码蛋白具有典型M、I、K和C结构。本研究通过对CmAP1蛋白进行在线分析，结果表明该蛋白属于植物MADS-box超家族，具有该家族特有的MADS_MEF2_like高度保守结构域及半保守K-box域，MADS_MEF2_like域是序列特异的DNA结合基元，K-box域是蛋白分子间相互作用的区域（Yang and Jack，2004）；C端可变最不保守，但MADS-box蛋白常含有一些保守基序，这些基序在蛋白复合体的形成和转录激活中起着重要作用（Honma and Goto，2001），同时C端不同的基序代表了MADS-box蛋白不同的功能（Lamb and Irish，2003），CmAP1基因在进化上属于euAP1分支，euAP1类基因编码的氨基酸序列在C末端具有典型的euAP1基序，常以CFAA结尾。

本研究运用实时荧光定量PCR对菊花花期CmAP1基因在不同部位的表达进行分析，结果表明，CmAP1基因在营养器官中表达量很低，在花蕾中表达量最高，在舌状花和管状花中表达量无明显差异。梁芳等（2016）研究发现，菊花品种狮子头CmFUL基因在管状花和舌状花中表达模式明显不同，在管状花中的表达量是舌状花中的12倍，表明同为AP1/FUL亚家族基因其功能存在差异。本研究构建了以CaMV 35S为启动子、GUS为报告基因、含有CmAP1目的基因的植物表达载体pCAMBIA1300-CmAP1，经双酶切及PCR鉴定确定CmAP1基因已成功转入农杆菌EHA105中。

4 结论

CmAP1基因在花的发育及形成过程中发挥重要作用，成功构建获得的植物表达载体pCAMBIA1300- CmAP1可为后期利用基因工程手段改变菊花花形态结构、调控花期及遗传改良打下基础。

参考文献：

崔波，蒋素华，刘佳，田云芳，袁秀云，马杰. 2013. 萼脊兰AP1-like基因的克隆与表达分析[J]. 西北植物学报，33（9）：1739-1744. [Cui B，Jiang S H，Liu J，Tian Y F，Yuan X Y，Ma J. 2013. Cloning and expression analysis of AP1-like gene from Sedirea japonica[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，33（9）：1739-1744.]

樊春媛，印敬明，王冰，韦青，李根涛，张云峰，杨清. 2010. 马铃薯StAP1基因的分子克隆与表达分析[J]. 植物生理学通讯，46（9）：933-938. [Fan C Y，Yin J M，Wang B，Wei Q，Li G T，Zhang Y F，Yang Q. 2010. Molecular cloning and expression analysis of a potato StAP1 gene[J]. Plant Physiology Communications，46（9）：933-938.]

梁芳，许申平，蒋素华，袁秀云，崔波，张静. 2016. 菊花MADS-box基因的克隆与表达载体构建[J]. 华北农学报，31（3）：25-31. [Liang F，Xu S P，Jiang S H，Yuan X Y，Cui B，Zhang J. 2016. Cloning，expression and vector construction of a MADS-box gene in Chrysanthemum morifo-

lium[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica，31（3）：25-31.]

鄒冬梅，刘月学，张志宏，李贺，马跃，代红艳. 2012. 草莓AP1同源基因的克隆、表达及启动子分析[J]. 中国农业科学，45（10）：1972-1981. [Zou D M，Liu Y X，Zhang Z H，Li H，Ma Y，Dai H Y. 2012. Cloning，expression and promo-

ter analysis of AP1 homologous gene from strawberry（Fragaria×ananassa）[J]. Scientia Agriculture Sinica，45（10）：1972-1981.]

Alvarez-Buylla R E，Garcl？觃-Ponce B，Garay-Arroyo A. 2006. Unique and redundant functional domains of APETALA1 and CAULIFLOWER，two recently duplicated Arabidopsis thaliana floral MADS-box genes[J]. Journal of Experimental Botany，57（12）：3099-3107.

Becker A，Theiβen G. 2003. The major clades of MADS-box genes and their role in the development and evolution of flowering plants[J]. Plant Molecular Evolution，29（3）：464-489.

Chi Y J，Huang F，Liu H C，Yang S P，Yu D Y. 2011. An APETALA1-like gene of soybean regulates flowering time and specifies floral organs[J]. Journal of Plant Physiology，（168）：2251-2259.

Ellul P，Angosto T，García-Sogo B，García-Hurtado N，Martín- Trillo M，Salinas M，Salinas V，Lozano R，Martínez-Zapater M J. 2004. Expression of Arabidopsis APETALA1 in tomato reduces its vegetative cycle without affecting plant production[J]. Molecular Breeding，13（2）：155-163.

Fu J X，Qi S，Yang L W，Dai Y，Dai S L. 2014. Characterization of Chrysanthemum ClSOC1-1 and ClSOC1-2，homo-

logous genes of SOC1[J]. Plant Molecular Biology Reporter，32（3）：740-749.

Goloveshkina N E，Shchennikova V A，Kamionshaya M A，Skryabin G K，Shulga A O. 2012. Influence of ectopic expression of Asteraceae MADS box genes on plant ontogeny in tobacco[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，109（1）：61-71.

Honma T， Goto K. 2001. Complexes of MADS-box proteins are sufficient to convert leaves into floral organs[J]. Nature，409（6819）：525-529.

Huang H J，Chen S，Li H Y，Jiang J. 2015. Next-generation transcriptome analysis in transgenic birch overexpressing and suppressing APETALA1 sheds lights in reproduction development and diterpenoid biosynthesis[J]. Plant Cell Reports，34（9）：1663-1680.

Kaufman K，Melzer R，Theiβen G. 2005. MIKC-type MADS-domain proteins：Structural modularity，protein interactions and network evolution in land plants[J]. Gene，347 （2）：183-198.

Kong Z D，Shen Y X，Guo B，Dong X J，Li H Y，Liu P Y. 2015. Cloning and expression of an APETALA1-like gene from Nelumbo nucifera[J]. Genetics and Molecular Research，14（2）：6819-6829.

Lamb R S，Irish V F. 2003. Functional divergence within the APETALA3/PISTILLATA floral homeotic gene lineages[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，100（11）：6558-6563.

Litt A，Irish V F. 2003. Duplication and diversification in the APETALA1/FRUITFULL floral homeotic gene lineage：Implications for the evolution of floral development[J]. Genetics，165（2）：821-833.

Liu Y X，Kong J，Li T Z，Wang Y，Wang A D，Han Z H. 2013. Isolation and characterization of an APETALA1-like gene from pear（Pyrus pyrifolia）[J]. Plant Molecular Biology Reporter，31（4）：1031-1039.

Shan H Y，Zhang N，Liu C J，Xu G X，Zhang J，Chen Z D，Kong H Z. 2007. Patterns of gene duplication and functional diversification during the evolution of the AP1/SQUA subfamily of plant MADS-box genes[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，44（1）：26-41.

Shchennikova V A，Shugla A O，Immink R，Skryabin G K，Angenent C G. 2004. Identification and characterization of four Chrysanthemum MADS-box genes，belonging to the APETALA1/FRUITFULL and SEPALLATA3 subfamilies[J]. Plant Physiology，134（4）：1632-1641.

Shchennikova V A，Shugla A O，Sizeneva S E，Perkovskaya I N，Skryabin K G A. 2011. Diversification of functional activity of the chrysanthemum homeotic MADS-box gene CDM37[J]. Doklady Biochemistry and Biophysics，436（4）：29-31.

Shulga A O，Mitiouchkina Y T，Shchennikova V A，Skryabin G K，Dolgov V S. 2011. Overexpression of AP1-like genes from Asteraceae induces early-flowering in transgenic Chrysanthemum plants[J]. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant，47（5）：553-560.

Wang Y，Ma Y P，Fu J X， Qi S，Ma H Z，Dai S L. 2013. Isolation and functional analysis of the ClM8-FRUITFULL-like MADS-box gene from Chrysanthemum lavandulifolium[J]. Scientia Horticulturae，161（2）：125-133.

Yang Y Z，Jack T. 2004. Defining subdomains of the K domain important for protein-protein interactions of plant MADS proteins[J]. Plant Molecular Biology，55（1）：45-59.

（責任编辑 思利华）