含有取向纳米纤维束的神经移植物构建与神经修复应用研究

尹桂波　刘婕

摘要：为提高纳米纤维神经移植物的接触引导，设计了一种含有取向纳米纤维束的“芯鞘”型神经移植物，它利用静电纺高取向纳米纤维膜，两次卷绕形成“芯”和“鞘”，最后通过静电纺丝喷覆而成。利用扫描电镜观察并表征了纤维及其移植物形态，测试了力学性能，将此移植物用于大鼠10 mm坐骨神經缺损，术后两月通过体外刺激和组织学观察了修复效果。结果表明：通过调整静电纺收集转辊转速可获得高取向聚乳酸纳米纤维，纳米纤维膜工程应力和伸长率达到（49.32±14.83） MPa和17.71%±0.06%，利用该膜构建的神经移植物缝合强力达到（1.18±0.40） N/针，能支持与保护神经再生，移植两月后，大鼠能够感知热与外力刺激，组织学观察发现，有神经纤维和血旺细胞长入神经移植物，证明了该构建技术的可行性，并有可能为神经修复提供一种新的移植材料。

关键词：聚乳酸；纳米纤维；静电纺丝；神经修复；生物性能

中图分类号：TB383

文献标志码：A

文章编号：1009-265X（2017）06-0001-06

Construction of a Novel Nerve Regeneration Graft with NanofibersBundles and Its Application in Neural Tissue Engineering

YIN Guibo1，2， VICTOR Leung2， FRANK.K.Ko2， WOLFRAM Tetzlaff3， LIU Jie3

（1.School of Textile and Dying Engineering， Jiangsu College of Engineering and Technology， Nantong226007， China； 2.Advanced Fibrous Materials Laboratory， Department of material engineering，University of British Columbia， Vancouver， V6T 1Z4， Canada； 3.Department of Zoologyand Surgery， University of British Columbia， Vancouver， V5Z 1M9， Canada）

Abstract：To promote contact guidance， we constructed a novel nerve regeneration graft with ‘core shell structure. The aligned nanofibers membrane was collected using electrospinning technology and then rolled twice to form nanofibers bundle ‘core and ‘shell. The morphologies of nanofibers were observed using SEM and their alignment was characterized. The tensile and suture strength were also tested by a micromechanical tester. The results showed that desirable alignment could be obtained by adjusting rotation speed. Along the fiber axial direction， strength of aligned PLA nanofibers membrane reached （49.32±14.83） MPa， the elongation was17.71%±0.06%， which could protect and support nervous system tissue regeneration. The suture strength was more than adequate for suturing during implantation （1.18±0.40） N/needle. Two months after transplantation， rats could sense

heat and external stimulation， histological observation found that nerve fibers and Schwann cells infiltrated into the constructs from both proximal and distal nerve stumps. These results proved the feasibility of the construction technology. The new kind of graft may be a promising substitute for nerve regeneration.

Key words：PLA； nanofibers； electrospinning； nerve regeneration； biological properties

神经断裂后，所有到达神经末端的信号将消失，如没有外科手术的重新连接，横断神经将很难再生[12]。如神经被直接切断，可通过手术缝合，使“端与端”重新连接，然而长距离的神经缺损如果仅依靠手术缝合，易在断端间产生张力，难以达到理想治疗效果[3]。自体神经移植一直被认为是神经修复的主要方法，然而长距离的神经缺损修复时，自体神经修复成功率大大下降，且自体神经需要另外手术，对供体区带来感知并发症，手术风险加大[45]。因此人工神经受到人们关注，它不仅能实现长距离神经修复，关键是神经修复后可自行降解。与传统微米级材料相比，纳米材料展现了获得理想神经细胞活性的能力，降低了某些对神经修复不利的细胞活性，如反应性胶质细胞活性[67]。另外，近来研究发现取向静电纺纤维能够提供导向信号，诱导轴突和神经胶质细胞表达高度极化表型。

人工神经移植物大多设计成中空结构，以便于两神经断端嵌入缝合[8]，并保护和支持再生组织，另外它还有助于神经再生组织的重排和神经生长因子的释放。然而，利用静电纺丝技术通过转辊直接收集形成的神经导管，纤维径向平行排列，无法引导神经沿导管轴向生长，此外中空结构也不利于束状纤维的接触引导。基于上述弊端，为提高接触引导，又便于受损周围神经的缝合，本文通过静电纺丝和卷绕技术，构建了一种内含取向纳米纤维束的“芯鞘”式移植物，為神经移植提供一种新型材料。

1实验方法

1.1神经移植物的构建

1.1.1取向纳米纤维的制备

聚乳酸（Mw=1×105；SigmaAldrich）溶于氯仿/丙酮（2∶1，V/V；SigmaAldrich）中，形成质量分数为6%的纺丝液。利用NANON01A型静电纺丝机（MECC， Japan）进行静电纺丝，电压25 kV，流速1 mL/h，利用直径为20 cm的转辊收集纳米纤维，转辊转速分别为1 000，1 500，2 000 r/min。

1.1.2纳米纤维膜的形态观察与取向表征

利用扫描电镜观察纤维形态，并利用Photoshop软件测试纤维直径，利用ImageJ软件和Oval Profile插件表征纤维取向，即通过傅里叶变换（FFT）将扫描电镜照片转换为像素图，然后利用Oval Profile插件，以像素图中心为圆心，以1°为间隔，沿半径方向计算像素强度和，纤维取向越高，像素和差异越大，形成的峰就越窄越高。

1.1.3含有纳米纤维束的神经移植物构建

图1为含有取向纳米纤维束的芯鞘型神经移植物构建图。如图1所示，把高速转辊收集的高取向聚乳酸（PLA）纳米纤维膜垂直纤维方向剪成10 mm的长条（可根据断裂神经长度调整），卷绕形成纳米纤维束“芯”。然后，再剪15 mm左右长条，卷绕在芯的表面，两端形成2～3 mm的鞘，最后再用静电纺丝喷覆一层纳米纤维膜，形成双层“鞘”。

1.2力学性能测试

1.2.1断裂强力测试

采用MTSTytron 250微型强力机，沿平行与垂直纤维排列方向，测试纤维膜力学性能，纤维膜长度70 mm，宽度5 mm，夹持长度30 mm，拉伸速度0.05 cm/s，每个试样测试5次。先测试膜的面密度，然后依次计算比应力和工程应力，具体公式如下：

比应力gtex=载荷（g）面密度gm2×宽度（mm）（1）

工程应力（MPa）=比应力gtex×9.81×ρpolymer（2）

式中：tex—纤维线密度单位，指1 000 m长的纤维所具有的重量；ρpolymer—聚合物密度。

1.2.2缝合强力测试

在距离缝合端2 mm处，利用MTSTytron 250强力机测试缝合强力，拉伸速度0.05 cm/s，每个试样测试3次，含有取向纳米纤维束的芯鞘型神经移植物缝合强力测试示意见图2。

1.3体内移植与组织学观察

1.3.1体内移植

SD大鼠称质量后用10%水合氯醛（300 mL/kg）腹腔注射麻醉，取左后肢股后外侧切口长约4 cm，于股后肌间隙找到坐骨神经，在梨状肌下方约5 mm处切除8 mm长的坐骨神经，使其断端回缩造成10 mm长神经缺损（图3（a））。将神经断端分别套入神经移植物“鞘”内1 mm，显微镜下7-0无创缝合针线将神经外膜与神经移植物“鞘”层缝合两三针固定（图3（b））。

1.3.2组织学观察（免疫组织化学染色）

术后8周取出神经移植物，分别对神经移植物近、远端进行横向、纵向切片，采用羊抗鼠IgG1 Alexa 594和羊抗兔 IgG Alexa 488对NF160和S100蛋白进行标记，观察轴突（NF160）和血旺细胞（S100）生长情况。

2结果与讨论

2.1PLA纳米纤维形态与取向观察

现有研究表明，在取向纳米纤维上的神经元突起长度明显比在无序纳米纤维上的长，取向纳米纤维能够引导轴突生长[9]。因此，首先研究了静电纺丝转辊转速这一影响纤维取向的最重要因素。图4显示了在不同转速下获得的扫描电镜照片及其傅里叶变换照片，以1°为间隔，沿半径方向的像素强度和统计显示在图5中。结果显示，转速为1 000 r/min时获得的纤维扫描电镜照片经傅里叶转换后，0～180°内（181～360°对称）像素强度几乎相同，表明纤维呈无序状排列。而当转速达到1 500 r/min时，从扫描电镜可直接观察到取向，图5中可观察到沿纤维取向，像素和明显提高，出现峰状像素强度图，说明在该转速下可获得一致的取向性。在高压静电作用下，喷射流的螺旋形快速伸展与分化被认为是纳米纤维无序状原因，当收集转辊表面线转速等于或大于静电纺丝速度时，能够拉直喷射流故能获得理想的纤维取向。然而当转速达到2 000 r/min时，从图4、图5中又可发现纤维的取向性下降，这可能是高速转辊表面的气流所致。

2.2神经移植物形态

传统意义上，神经移植物大多设计成管状，以便于神经断端缝合和长入。然而，如果直接利用细转辊收集纳米纤维形成管状移植物，纤维呈径向平行排列，与导管轴向平行，这将不利于神经的接触引导。为克服这一不足，设计了先纺丝再卷绕的构建

路线，图6（a）、（b）显示了该神经移植物的外观形态，它的长度和直径可根据受损神经的尺寸予以调整，在本实验中移植物纤维束“芯”长度为10 mm，直径为3 mm，整个移植物的直径为3.2 mm，长度15 mm左右。图6（c）显示了该神经移植物横截面扫描电镜照片，由图6（d）、（e）能进一步观察到该移植物由数以万计的平行纳米组成，纤维直径（480±75 nm），这为受损神经提供了更多接触引导可能。此外，通过卷绕形成的纤维束还会产生较多的层间空隙，这又将便于再生神经长入及营养与代谢物的转移。

2.3力学性能

2.3.1纤维膜的拉伸性能

神经移植物的机械性能对其移植后的完整与稳定性具有重要影响，移植物必须提供足够的生物力学性能，才能支持组织再生和降解。因此，首先测试了平行与垂直纤维取向的纤维膜力学性能，此外，鞘的外层是无序排列纤维膜，因此也测试了该纤维膜的力学性能。

图7显示了不同取向纤维膜的力学性能，表1为其统计结果。结果发现，垂直纤维膜的比应力为（0.26±0.04） g/tex，與之相比，沿纤维取向拉伸时，纤维膜比应力达到4.19 g/tex，是垂直纤维取向拉伸的16倍，表明纤维平行排列极大提高了膜的强力。此外，尽管平行方向比垂直方向的断裂伸长率低，但仍达到17.71%±0.06%，表明具有良好的柔韧性，这将有利于保护和支持沿纤维取向的神经重排与再生。非取向纤维膜与取向纤维膜相比，其强力介于垂直与平行方向之间。如直接用取向膜包缠形成移植物的鞘难以满足力学要求时，可以通过喷覆非取向纤维膜以提高强力。

2.3.2缝合强力

为了测试该移植物的临床应用，测试了缝合强力，如图8、表2所示，尽管卷绕了3层平行纤维膜，然而其缝合强力仅为（0.45±0.09） N/针，这将难以满足缝合要求。为提高缝合强力，在卷绕层表面喷覆了一层无规纤维（纤维层的厚度为32 μm），无序排列纤维层的强力为（0.22±0.01） N/针。尽管这两层之和似乎仍不能满足缝合要求，然而有趣的是，通过两层的相互作用，其缝合强力达到1.18±0.40 N/针，将满足神经移植的缝合手术要求（手术缝合要求超过1.0 N/针）。

2.4体内移植观察

对大鼠左后脚进行外力和热刺激，发现大鼠左腿运动明显，具有明显的感知。免疫组织化学分析，在近、远端横向切片均发现有再生神经纤维（红色）和雪旺细胞（绿色）长入（图9），表明再生神经和细胞能够长入卷绕形成的纤维膜空隙，通过纵向切片发现有沿着纤维取向的再生神经，并穿过10 mm间隙，这表明纳米纤维确有引导神经再生的可能。

3结论

在合适的静电纺丝工艺条件下，利用高速转辊能够获得理想取向的PLA纳米纤维膜，力学性能测试发现该膜在平行纤维方向具有良好的柔韧性。通过两次卷绕和一次静电纺丝喷覆后形成的含有纳米纤维束的“芯鞘”式神经移植物，具有满足临床手术的缝合强力，移植后发现在受损神经近、远端均有再生神经和血旺细胞长入，再生的神经能够穿过受损间距，与纤维取向一致，表明该移植物构建和体内移植神经修复的可行性。下一步将研究多通道纳米纤维束，形成更大的神经再生空隙，负载神经因子，选用其它具有良好生物相容性和降解性的高聚物，以期利用该技术开发出具有类似自体神经修复功能的人工神经移植物。

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（责任编辑：张会巍）