低分子肝素软膏剂的制备与质量控制

杨富溶 沈建华

摘 要：本研究制备了低分子肝素（LMWH）软膏剂并建立了制剂质量控制方法。按照不同处方和制备工艺制得软膏剂基质，通过软膏剂综合评分法对所制得基质进行评价。将LMWH原料药溶解，合并入基质水相组分，按照所确定的软膏剂最佳处方和最优工艺，制备LMWH软膏剂。用羊血浆法分别测定原料药和制剂中LMWH的效价。结果表明，按照处方1制备工艺3所制得的软膏剂基质综合评价得分最高。测得的软膏剂中LMWH含量为147.03U/g，为标示量的91.89%。因此，本研究中LMWH软膏剂的制备方法可行，制剂质量控制方法简单快速，适合少量制备LMWH外用剂型。

关键词：低分子肝素；软膏剂；效价；羊血浆法

低分子肝素（LMWH）是肝素经降解得到的低分子量的肝素片段或经分级法得到的低分子量肝素组分，仍为多糖类物质，具有类似肝素的抗凝活性。研究表明，LMWH除了具有抗凝活性之外，还有诸如抗炎、抗过敏等其他药理活性，可应用于相关疾病的治疗[1]。软膏剂为外用剂型之一，涂敷后于病变部位释药治疗疾病，避免了口服给药的胃肠道破坏与肝首过效应，可减少血药浓度波动，是克服药物副作用的有效用药途径之一[2]。本研究拟制备LMWH软膏剂，并探究制剂中LMWH效价的测定方法以进行制剂质量控制。

1 实验部分

1.1实验试剂与仪器

LMWH原料药系实验室自制，LMWH标准品（效价60U/mg）从惠兴生化试剂有限公司购买，绵羊血浆（标准条件下血浆半凝固度剂量Vl/2为180μL）从东营爱博科技助剂厂购买，其他试剂为分析纯。

JM-L型胶体磨（苏州明冠胶体磨厂）。

1.2 实验方法

1.2.1软膏剂基质处方

软膏剂基质有油脂性、水溶性与乳剂型。基于此前的研究，本研究选用乳剂型基质[3]。

处方l：以100g为例，单硬脂酸甘油酯7g，白凡士林10g，硬脂酸10g，液状石蜡10g，甘油14g，水48g，十二烷基硫酸钠1g，羟苯乙酯0.1g。

处方2：以100g为例，单硬脂酸甘油酯6g，白凡士林11g，硬脂酸10g，液状石蜡10g，甘油14g，水48g ，十二烷基硫酸钠1g，羟苯乙酯0.1g。

处方3：以100g为例，单硬脂酸甘油酯5g，白凡士林10g，硬脂酸10g，液状石蜡10g，甘油16g，水48g，十二烷基硫酸钠1g，羟苯乙酯0.1g。

1.2.2软膏剂基质制备工艺

本研究所使用的软膏剂基质为O/W乳剂型基质。乳剂型基质中有3种组分，即水相、油相与乳化剂。制备时，可以两相同时掺和，也可以将油相加入水相或将水相加入油相。乳化剂可以先加入水相或先加入油相，也可以水油两相掺和后再后加。

工艺1：油水分相法。

按1.2.1项下所列各处方，将单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林、液状石蜡置于烧杯中，水浴加热至熔化作为油相，保温于85℃。取甘油加入蒸馏水中，加入十二烷基硫酸钠以及羟苯乙酯加热溶解作为水相，并保温于85℃。在搅拌下将水相缓慢加入油相中，搅拌至冷凝即得[4]。

工艺2：后加乳化剂法。

按1.2.1项下所列各处方，将除十二烷基硫酸钠以外的所有组分置于烧杯中，水浴加热至熔化，保温于85℃。另将乳化剂十二烷基硫酸钠用少量蒸馏水溶解，并保温于85℃，在搅拌下将该乳化剂水溶液加入上述基质混合物中，搅拌至冷凝即得[4]。

工艺3：高剪切匀乳法。

按1.2.1项下所列各处方，将油相组分、水相组分分别置于烧杯中，水浴加热，并保温于85℃。将水相加入胶体磨中，再加入油相，持续搅拌5 min即得[4]。

1.2.3软膏剂基质处方及制备工艺评价

（l）离心后考察。分别离心各组软膏剂基质，轉速为4000 r/min，10 min后考察其是否出现粗粒。

（2）放置后考察。室温下各组软膏剂基质放置7d，考察其外观性状。以外观性状及稳定性作为考察指标，采用综合评分法对不同处方及制备工艺制得的基质进行评价[5]。

1.2.4 LMWH原料药效价测定

（l）标准品溶液制备。称取LMWH标准品（60U/mg）适量，用生理盐水准确稀释至8U/mL，最为标准品溶液。

（2）原料药供试液制备。按原料药估计效价（33U/mg），精确称取约0.69LMWH原料药置100 mL容量瓶中，用生理盐水定容至刻度，充分混匀，作为储备液。另精确吸取1.0mL至25mL容量瓶中，加生理盐水至刻度，混匀，作为原料药供试液[6]。

（3）效价测定。取冰冻血浆1瓶，融化，过滤。取14支试管，分为两组，每组7支。一组加入1.2.4项下标准品溶液，另一组加入1.2.4项下原料药供试品溶液，以180μL为中点，5μL为级差，依次加入对应体积的溶液，即165、170、175、180、185、190、195μL。向各管加入血浆1mL，再加入0.25%的氯化钙溶液0.8mL。盖好管塞，每管以同样的方法倒转3次，混匀内容物，并使整个管内壁润湿。将所有试管垂直放置于37℃水浴中，并开始计时。1h后取出所有管，观察并记录血浆凝固程度，以血浆半凝固对应的待测液体积为准[6]。

分别测定准品与原料药的血浆半凝固度剂量SVl/2与TVI/2。原料药的效价按照如下公式计算：

原料药的效价= SVl/2/ TVI/2X8X25×lOO/mr

公式中：mr为所取原料药的毫克数，效价的单位为U/mg。

1.2.5 LMWH软膏剂的制备

根据1.2.4项所测得的原料药效价值，按照软膏剂中LMWH的标示含量160U/g的要求，准确称取LMWH原料药，用适量水溶解LMWH原料药（该部分水量从基质处方中扣除），将该药液合并入基质的水相中。按照1.2.3项软膏剂基质处方及制备工艺考察的结果，采用最佳处方与最优工艺制备LMWH软膏剂。

1.2.6軟膏剂中LMWH含量的测定

制剂中LMWH的效价测定是质量控制的关键。以软膏剂中LMWH的标示含量为准，精密称取LMWH软膏剂约5g，置100 mL容量瓶中，加无水乙醇30mL，水浴加热溶解后，加O.9%NaCI溶液定容，混匀，0～4℃放置过夜分层，弃上层油脂，取下层过滤，全部滤液转移至置蒸发皿内，水浴加热除乙醇至无乙醇嗅味，残余溶液转移至100mL容量瓶中，O.9%NaCI溶液定容，即得软膏剂供试液[7]。测定软膏剂供试液的血浆半凝固度剂量PVl/2，方法同1.2.4项。软膏剂中LMWH的含量按照如下公式计算：

软膏剂中LMWH的含量=SVI/2/PVl/2X8X100/mp

公式中：mp为所取软膏剂的克数，含量的单位为u/g。

2结果与讨论

2.1软膏剂基质处方与制备工艺评价结果

离心后发现，处方3的不同制备工艺所制得的基质都出现粗粒；按照处方l与处方2制得的基质离心后未出现粗粒，结果如表1所示。

所有基质放置7d后，采用综合评价法进行评价，结果见表1。处方中单硬脂酸甘油酯含量最高而白凡士林、甘油含量较低，即采用处方l时，所得软膏外观性状最好，性质稳定，综合评价得分高于处方2与处方3，因此处方1为最佳处方。采用处方l时，油水分相法制备的软膏剂基质在外观性状与稳定性方面综合评分最低，后加乳化剂法稍高，而高剪切匀乳法制备的软膏剂基质外观性状与稳定性方面评分最高，因此确定处方1为最佳处方，工艺3为最优工艺。

对软膏剂基质处方和制备工艺考察结果表明，处方中各组分的不同配比影响膏体的稠度，当单硬脂酸甘油酯含量高，而甘油、白凡士林含量适中时，所得基质稠度适中，不过度稠厚也不显稀薄。而当单硬脂酸甘油酯含量降低，甘油含量升高时，基质稠度降低，稍稀；白凡士林含量升高时，基质稠厚，涂展性差。在基质制备工艺中，搅拌速度越快，剪切力越大，所制得的乳化体系越稳定。因而，高剪切匀乳法所制得的基质稳定性最好，离心及久置不出现粗粒，也没有油水分层现象。乳化剂的加入顺序也会影响软膏的性状以及稳定性。后加乳化剂法因油相与水相组分在乳化剂加入之前，已经搅拌混合成分散体系，加乳化剂后因乳化作用进一步分散，故其稳定性稍好于油水分相法。

2.2 LMWH原料药效价

经测定，LMWH标准品的SVl/2为170μL，原料药的TVI/2为190μL。计算得LMWH原料药的效价为29.82U/mg。

2.3 LMWH软膏剂的制备

按照所测得的LMWH原料药的效价并结合软膏剂中LMWH的标示含量，精密称取0.5366g原料药，按照1.2.1项下处方l，用48mL水溶解，，加入甘油、十二烷基硫酸钠及羟苯乙酯加热溶解作为水相，保温于85℃。另照1.2.1项下处方1将油相组分单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林、液状石蜡水浴加热至熔化，保温于85℃。按照1.2.2项下工艺3将水相加入胶体磨中高速搅拌，将油相加入上述水相中，搅拌5min即得LMWH软膏剂。

LMWH作为生物活性物质，其在制剂中的化学含量（原料药质量/制剂质量）并不高。本研究中所制得的LMWH软膏剂，其化学含量仅为0.5366g/lOOg软膏剂。正是因为其在制剂中的化学含量小，不到1%，其对于软膏剂基质的影响可以忽略。将本研究中所制得的LMWH软膏剂进行离心实验，未出现粗粒，所得制剂与软膏剂基质的综合评分的结果一样。

2.4软膏剂中LMWH含量

经测定，LMWH标准品的SVI/2为170μL，软膏剂供试品的PVI/2为185μL。计算得软膏剂中LMWH含量为147.03U/g，为标示含量的91.89%。

LMWH为酸性多糖，结构中含有硫酸基团，可溶于水，作为具有一定分子量的生物分子，其发挥作用时要求保持特定的空间结构，所以仅有LMWH的化学实体并不能保证其具有药理活性，因而，该药物的含量必须用效价（活性单位数∕制剂质量）进行标示。LMWH以用天青A法进行测定。该方法测得的为化学含量，其数值与LMWH的生物活性之间没有良好的线性关系。如要使用该法，则每次测定需建立其与生物检定法间符合线性关系的浓度范围，步骤繁琐，且结果会因每批LMWH的来源、生物活性差异而出现波动。因此，中国药典以及美国药典都要求采用生物检定法进行检定。中国药典规定用兔血浆法，而美国药典采用羊血浆法，本研究采用羊血浆法进行测定。

用羊血浆法进行测定时，关键数据为实验条件下实际的血浆半凝固度剂量。本研究中所购的羊血浆半凝固度剂量标示为180μL（标准条件下），因此即以待测液体积180μL作为中位值，5μL为级差，分别测得SVI/2、TVI/2、 PVl/2，简单快速，缩短了效价测定的时间。

本研究中，LMWH软膏剂的标示含量为160U/g，而实际测得的含量为147.03U/g，为标示含量的91.89%。原因可能是在制备软膏剂供试品溶液的过程中造成了LMWH生物活性的部分损失。但测得值在标示量的±10%以内，仍然符合制剂中含量检测的要求，可以作为制剂中药物含量的检测方法。当然，制剂中含量测定还需要进一步进行精密度、回收率实验，确保含量检测方法的系统适应性。

3结语

总之，本研究所制备的LMWH软膏剂符合制剂的要求，并且建立了简单快速测定原料药LMWH效价与制剂中LMWH含量的方法，进而能够对LMWH软膏剂进行质量控制，可供少量制备LMWH外用剂型参考。

[参考文献]

[1]臧恒昌，翟光喜.低分子肝素纳米脂质体的制备及家兔鼻腔吸收的研究[J].中国药学杂志，2003，38 （3）：196-198.

[2]李文飞，李承明，辛林林，等肝素钠软膏在皮肤科的应用[J].中国生化药物杂志，1998，19 （5）：350-352.

[3]刘贵江，沈建华肝素钠软膏剂的制备与质量控制[J].科技展望，2015，25 （34）：52.

[4]李 菲，宋 涛.硝苯地平软膏剂的制备与质量控制[J].泰山医学院学报，2007，28 （2）：90-92.

[5]李耀荣，莫玉芳，消丽英.正交实验法优选新康松乳膏的制备工艺[J].中国药业，2005，14 （8）：59-60.

[6]郭凤仙，崔向珍，刘 丽.不同浓度氯化钙溶液对羊血浆法测定肝素钠效价的影响[J].中国生化药物杂志，2000，21（2）：76-78.

[7]王 磊，焦 楠，李传秋，等.羊血浆法测定海普林软膏中肝素钠生物效价的探讨[J].中国生化药物杂志，2002，23 （3）：149-150.